CtFDH production in Pichia pastoris using a novel expression system - Duraksoy, Bedri Burak (Gebze Teknik Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, 2020)
Format dehidrogenaz enzimi (FDH), formatın karbondioksite (CO2) yükseltgenmesini katalizlerken, koenzim olarak NAD+'ı NADH'a indirgeyerek oluşturmaktadır. Bu nedenle uzun bir süre, NADH bağımlı reaksiyonlar için iyi bir NADH yenileyececisi olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca son dönemde FDH için yapılan çalışmalar, bu enzimin aynı zamanda tersinir yönde CO2'in formata indirgenmesinde de aktivite gösterdiğini rapor etmiştir. FDH'ın bu yeni ozelliklerinin endüstiride uygulanması, enzimin düşük maliyetler ile verimli şekilde üretilmesine bağlıdır. Önerilen çalışmada, Chaetomium thermophilum FDH'nin (CtFDH)'un daha yüksek verimde, düşük maliyetler ile üretilmesi için yaygın kullanılan E. coli ifade sistemi yerine son dönemde en çok kullanılan Pichia pastoris ifade sistemi kullanılmıştır. CtFDH enzimini kodlayan gen pPICZ?A plazmidine klonlandıktan sonra, Pichia pastoris X-33 hücresine protein ifadesi için aktarılmıştır. CtFDH'ın yüksek protein ifadesini sağlamak için hücre kültürünün büyüme koşulları optimize edilmiştir. Hücre kültürü ortamında, hücre dışına salgılanan CtFDH enzimi affinite kromotografisi yöntemi ile saflaştırılıp, saflığı sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide jel'de kontrol edilmiştir. Elde edilen yüksek saflıktaki aktif CtFDH'in miktarı, P. pastoris ifade sisteminin yüksek verimde protein üretimi için iyi bir seçenek olduğunu göstermektedir. Endüstriyel seviyede protein üretimi için farklı fermentasyon stratejilerinin tasarlanan protein ifade sistemine adaptasyonu gelecek çalışma olarak düşünülmektedir.

Formate dehydrogenase enzyme (FDH) catalyzes the oxidation of formate to carbon dioxide (CO2) and reduces NAD+ into NADH. Therefore, for a long time, it has been considered as a good NADH regeneration method for NADH dependent reactions. In addition, recent studies for FDH have reported that this enzyme also shows successful activity in the reversible reduction of CO2 to formate. The industrial application of these novel features of FDH depends on the efficient production of the enzyme at low costs. In the proposed study, the widely preferred Pichia pastoris expression system was used instead of the common E. coli expression system to produce Chaetomium thermophilum FDH (CtFDH) with higher efficiency and low costs. After the gene encoding the CtFDH enzyme was cloned into pPICZ?A plasmid, it was transferred to the Pichia pastoris X-33 cell for protein expression. The growth conditions of the cell culture have been optimized to ensure high protein expression of CtFDH. In the cell culture medium, the CtFDH enzyme was secreted outside of the cell, and it was purified using the affinity chromatography method. Its purity was confirmed using the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. The obtained amount of highly pure and active CtFDH indicates that the P. pastoris expression system is a good option for high yield protein production. The designed protein expression system for an efficient protein production can be adapted for an industrial level production using different fermentation strategies as a future study.
Pichia pastoris ifade sistemi kullanılarak CtFDH üretimi
Keywords: Biyoloji; Biology; Biyoteknoloji