Probing clock proteins in live cells by fluorescence

Abstract

Canlı organizmaların fizyolojik aktivitelerini günlük (sirkadiyen) döngüde kontrol eden otonom bir mekanizma olan biyolojik saat, temelde dört farklı proteinin transkripsiyon ve translasyon döngüsü ile ayarlanır. Bu proteinler biyolojik saatin yanısıra hücrenin temel fonksiyonlarına protein ve DNA seviyesinde etki ederek hücresel süreçlerin dengeli ve doğru çalışmasını sağlar. Dolayısıyla biyolojik saatin bozulmasının, metabolizmaya bağlı birçok hastalık ile doğrudan yada dolaylı yoldan ilişkilidir ve birçok çalışma ile de desteklenmektedir. Bu durum, sirkadiyen ritim ve metobolik bileşenler arasındaki bağlantıyı anlamanın hastalıklara karşı yeni ilaç ve terapatik ajanlar geliştirilmesindeki potansiyelini açıkça ortaya koymaktadır. Bu amaçla laboratuvarımızda yürütülen çalışmaların, detaylandırılarak daha ileriye taşınması ve daha kararlı bulguların ortaya konulması çok önemlidir. Bu sebeple yapmayı planladığımız çalışmamızda, rekombinant gen teknolojisi (gen klonlama), hücre kültürü ve fluoresans okuma teknikleri kullanılarak belirlenen biyolojik saat genlerinin fluoresans mikroskop ile gerçek zamanlı görüntülemesinin yapılmasına olanak sağlayacak iki farklı hücre ortaya çıkartılacaktır. Bu rekombinant proteinler, kendilerine ait doğal düzenleyeci gen bölgeleri tarafından ifade edilecekler. Bu sistem biyolojik saat proteinlerinin in vivo endojen gen anlatımını mimikleyerek hücre içi yerlerinin ve terapatik ajanlar ile olan etkileşimlerinin gözlemlenebilmesine olanak sağlayacaktır. Çalışma sonunda, BMAL1 ve Cry1 proteinlerinin hücre içi fonksiyonlarına ve başka bileşiklerle olan etkileşimlerine dair bulgular ortaya konulacaktır. Bu çalışma, biyosensör hücrelerin biyolojik saat proteinlerine dair özelliklerin incelenmesinde nasıl faydalanabileceğini de ortaya koyacak ve iyi bir altyapı sağlayacaktır.In most living organisms, biological clock which is an autonomous mechanism that control physiologic activities in daily (circadian) cycle is regulated by the transcription and translational cycle of four proteins. These are not responsible only for biological clock but also for many cellular processes in protein and DNA level to adjust homeostasis between them. Therefore, disruption of biologic clock directly or indirectly related with many metabolic diseases and this has been proven by many studies. This situation clearly shows the potential of to understand the relationship between biological clock and metabolic components about improvement of new drugs and therapeutic agents. Thus, it is important to elaborate the studies that have been preceded in the laboratory which makes them more significant. In this study, it is aimed to develop new tools that give opportunity for real-time imaging of biological clock proteins by using recombinant gene technology (cloning), cell culture and imaging in stably generated U2OS cells. These recombinant proteins will be expressed from their own promoters. In that tool, it is possible to mimicking in vivo endogenous gene expression of the proteins. At the end of the study, it will be obtained new findings about the function and relationship of BMAL1 and Cry1 proteins between other molecules. This study will also demonstrate how biosensor cells can exploit the properties of clock proteins.