Kitosan karbon nanotüp komposit matriksli amperometrik nitrit biyosensörü geliştirilmesi

Abstract

Nitrit çevrede ve fizyolojik sistemlerde bulunabilen önemli bir inorganik toksik kirleticidir. İnsan vücudunda nitrit hemoglobin ile birleşerek methemoglobini oluşturmakta ve bu zararlı madde mavi bebek sendromuna sebep olmaktadır. Ayrıca nitrit nitrozamine dönüşerek kanser ve hiper tansiyona sebep olabilmektedir. Bu olumsuz etkileri nedeniyle nitritin hızlı ve kolay bir şekilde ölçülebilmesi için yeni metot arayışları devam etmektedir. Nitrit tayini için spektrofotometrik ölçüme dayalı bir yöntem olan Griess metodu yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra elektrokimyasal, kromatografik, kapiller elektroforez ve elektro kimyasal ışıldama kemilüminesans yöntemleri de nitrit ölçümü için kullanılabilmektedir. Ancak bu yöntemler yorucu veya zaman alıcı yöntemler olup daha kısa sürede sonuç veren nitrite spesifik ölçüm metotlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Geliştirilmekte olan nitrite spesifik metotlardan biri de nitrit redüktaz veya oksidaz enzimlerinin kullanıldığı biyosensörlerdir. Bu tez kapsamında geliştirilen biyosensörde biyoajan olarak kullanılan E. coli nitrit redüktaz enzimine (NirB) ait gen Gebze Teknik Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü Biyoteknoloji laboratuvarında daha önceki çalışmalarda klonlanmış ve enzim karakterize edilmiştir. Enzimin biyosensör çalışmaları için ideal bir biyo-ajan olduğu gösterilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında NirB nitrit redüktaz enzimi kitosan ve karbon nanotüp kompozit matrisi (CHIT/MWCNT) ile camsı karbon elektrot yüzeyine tutuklanmış olup kitosan ve karbon nanotüp konsantrasyonlarının biyosensörün tespit limiti ve hassasiyetine olan etkileri araştırılmıştır. Komposit matristeki %0,4 kitosan ve 0,5 mg/ml karbon nanotüp konsantrasyonlarının nitrit tespiti için optimum olduğu belirlenmiştir. Hazırlanan biyosensörün tespit limitinin (LOD) 1.3 µM ve hassasiyetinin ise 168 mA/M.cm2 olduğu tespit edilmiştir. Yağmur suyunda nitrit tespit başarılı bir şekilde yapılmış ve NirB enzimi ile hazırlanan amperometrik biyosensörün çevresel numunelerde kullanım için uygun olduğu gösterilmiştir.Nitrite is an important inorganic toxic pollutant that can be found in the environment and physiological systems. In the human body, nitrite combines with hemoglobin to form methemoglobin, which is a harmful substance that causes methemoglobinemia, also known as blue baby syndrome. Additionally, nitrite can convert into nitrosamines, leading to cancer and hypertension. Due to these adverse effects, there is a continuous search for new methods that can rapidly and easily measure nitrite. The Griess method, which is based on spectrophotometric measurement, is widely used for nitrite determination. Moreover, electrochemical, chromatographic, capillary electrophoresis, and electrochemical luminescence chemiluminescence methods can also be used for nitrite measurement. However, these methods are often tedious or time-consuming, necessitating the development of nitrite-specific measurement methods that provide results in a shorter time. One of the emerging nitrite-specific methods involves biosensors using nitrite reductase or oxidase enzymes. In this thesis, the gene encoding the nitrite reductase enzyme (NirB) to be used in the biosensor was previously cloned from E. coli and characterized at the Biotechnology Laboratory of the Environmental Engineering Department at Gebze Technical University. The enzyme was shown to be an ideal bio-agent for biosensor studies. In this thesis, the NirB nitrite reductase enzyme was immobilized onto a glassy carbon electrode surface with a chitosan and carbon nanotube composite matrix (CHIT/MWCNT), and the effects of chitosan and carbon nanotube concentrations on the detection limit and sensitivity of the biosensor were investigated. It was determined that the optimal concentrations of the composite matrix for nitrite detection were 0.4% chitosan and 0.5 mg/ml carbon nanotubes. The detection limit (LOD) of the prepared biosensor was found to be 1.3 µM, and its sensitivity was determined to be 168 mA/M.cm². Nitrite detection in rainwater was successfully performed, demonstrating that the amperometric biosensor prepared with the NirB enzyme is suitable to be used in environmental samples.