Temperature optimization for the active production of exo-polygalacturonase enzyme in Pichia pastoris protein expression systems in shake flask level and testing of apple pomace as a waste carbon source

Abstract

Poligalakturanazlar, meyve suları ve şarapların ekstraksiyonu, durultulması ve süzülmesinde kullanılan pektinaz grubuna ait enzimlerdir. Ekzo-poligalakturonaz enzimi hücre dışı salgılanan bir enzim olduğundan ekstraksiyon işlemlerine olan gereksinimi ortadan kaldırır böylece zamandan ve maliyetten tasarruf sağlar. Bu çalışma, Pichia pastoris GS115 suşundan ekzo-poligalakturonaz enziminin üretilmesini amaçlamaktadır. Endüstriyel alanda geri dönüşüme katkı sağlamak ve sürdürülebilirliği sağlamak için atık karbon kaynağı elma posası kullanılarak rekombinant Pichia pastoris GS115 hücresinden erlen seviyesinde üretim yapılması hedeflenmiştir. Enzim, 72 saatlik inkübasyon ile 3 farklı sıcaklık (18 ºC, 20 ºC ve 24 ºC) ve 3 farklı metanol indükleme konsantrasyonu (toplam BMMY hacminin %1.0, %1.5 ve %2.0 'si) kullanılarak optimize edildi. Enzim aktivitesi, enzim ultrafiltrasyon işlemine tabi tutulduktan sonra ve saflaştırılmamış ham formunda 60 ºC sıcaklıkta ve pH değeri 4 olan çevre şartlarında bakılmıştır. Enzim substratı olarak elma posasından elde edilen pektin ve polyglycolic acid (PGA) kullanılmıştır. En yüksek enzim aktivitesi 5,5 U/mL ve toplam protein miktarı 433.0 mg olarak ölçülmüştür. Değerler %1.0 metanol indükleme konsantrasyonunda ve 20 ºC methanol indükleme fazıyla elde edilmiştir. En yüksek aktivite değeri enzimin saflaştırılmamış halinden ve atık karbon kaynağı olarak elma posası denendiği deneylerde elde edilmiştir. Atık karbon olarak elma posasından yararlanılarak rekombinant Pichia pastoris GS115 hücrelerinden elde edilen exo-PG enzimi, meyve suyu klarifikasyonunda kullanılması hücrelerin büyüme ve metanol indükleme süresini kısalttığı için ekonomik bir çözümdür. Karbon kaynağı olarak elma posası kullanılarak Pichia pastoris'ten exo-PG üretimi endüstriyel boyuta kadar ölçeklendirilerek sağlanabilir, bu sayede değerlendirilen atıkların yanı sıra zaman ve enerji tasarrufu sağlanır. Daha sonra doldurulacaktır.Polygalacturanases are part of the pectinases group of enzymes that are used in the extraction, clarification and filtration of fruit juices and wines. Since the exo-polygalacturonase enzyme is synthesize outside the cell, the process also eliminates extraction methods. The thesis aims to produce the exo-polygalacturonase enzyme from Pichia pastoris GS115 strain. It was aimed to produce at shake flask level production with using apple pomace as a carbon source by using previously prepared recombinant strain for contributing the recycling and providing sustainability in the industrial area. The enzyme production parameters were optimized using 3 different temperatures (18 ºC, 20 ºC and 24 ºC) and 3 different methanol induction rate (1.0%, 1.5% and 2.0% of the total BMMY medium) with 72 hours of the incubation. Enzyme activity was studied at 60 ºC and pH 4 conditions with pectin from apple pomace and PGA are used as enzyme substrate at the crude form of enzyme and after the ultrafiltrated form. The highest enzyme activity is calculated as 5.5 U/mL from crude enzyme and total protein amount is calculated 433.0 mg with 1.0% methanol induction rate at 20 ºC methanol induction phase. It is obtained when using waste carbon source of apple pomace in modified BMGY medium. Using exo-PG enzyme obtained from recombinant Pichia pastoris GS115 cells by utilizing apple pomace as a waste carbon, source in fruit juice clarification is an economical solution as it shortens the growth and methanol induction time of the cells.