Solanum lycopersicum L. bitkisi ile agroinfiltrasyon ve CRİSPR/Cas9 yöntemi kullanarak pds genini susturma çalışmaları

Abstract

Domates (Solanum lycopersicum L.), Dünyanın en önemli taze ve işlenmiş meyvelerinden biridir ve Dünya meyve üretiminin %15'inden fazlasını oluşturmaktadır. Bu nedenle ekonomik açıdan en önemli mahsullerden biridir. Domates taksonomik olarak, Solanaceae familyası, Solanum cinsi, içerisinde yer alır. Aynı zamanda Solanaceae familyasından patates, patlıcan, biber, petunya ve tütün bitkilerini incelemek ve geliştirmek için yapılan çalışmalarda genetik olarak örnek bir bitkidir. Bu çalışmada gelecekteki gen düzeltme ile ilgili bitki ıslahı çalışmalarına öncülük etmesi amacıyla sera koşullarında yetiştirilen domates yapraklarına fitoen desaturaz (PDS) geninin CRISPR yöntemi ile susturulması ve albino bitkiler elde edilmesi için gerekli optimizasyon çalışmaları yapıldı. Denemeler sırasında istenilen her bir vektör için tekrarlanmak sureti ile ilgili Cas9 / gRNA vektörü kompetan üç farklı Agrobacterium tumefaciens suşlarına (1D1249, EHA105 ve C58C1) ısı şoku yöntemi kullanılarak transformasyonu yapıldı. Her bir suş infiltrasyonun bir gün öncesinde sıvı LB besi yerinde uygun antibiyotikler ile 200 rpm'de 30°C'de inkübe edildi. Yapılan optimizasyon çalışması kapsamında iki farklı seçici markır gen olan PDS ve GFP genleri domates bitkisine aktarıldı. Agroinfiltrasyon protokolünün optimize edilmesi için öncelikle farklı büyüme periyotlarındaki domates yaprakları denendi ve elde edilen sonuçlar 4 ve 5. haftaların transformasyon için en uygun zaman dilimi olduğunu gösterdi. Yapılan farklı OD600 denemelerinden sonra en iyi sonucun 0.8 OD değeri olduğu görüldü. Hazırlanan MES infiltrasyon tamponu yapraklara 1 ml'lik steril şırıngalar ile uygulandı ve her uygulamada yaklaşık 0.3-0.5 ml domates yapraklarına infiltre edildi. Tüm bu denemeler optimize edildiğinde, PDS geni susturulan domates yapraklarında istenilen albino fenotipe ulaşıldı. Ardından kontrol amacıyla GFP seçici markır geni ile yapılan agroinfiltrasyon sonucunda da UV altında alınan görüntüde olması gerektiği gibi yeşil ışıma görüldü ve infiltrasyon yapılmayan negatif kontrol bitkisinde hiç ışıma görülmemesiyle yöntem GFP markırı ile de doğrulandı. Optimize edilen protokol domateste in planta gen düzeltme çalışmalarını hızlandırmak için kullanılabilir.Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the world's most important fresh and processed fruits that accounts for more than 15% of world fruit production. It is therefore one of the most economically important crops. Tomato taxonomically belongs to the family Solanaceae, genus Solanum. At the same time, it is a genetically model plant to study and improve potato, aubergine, pepper, petunia and tobacco plants from the Solanaceae family. In this study, in order to pioneer future gene editing mediated plant breeding studies, the optimization studies were carried out to silence the phytoene desaturase (PDS) gene in tomato leaves grown in greenhouse conditions and to obtain albino plants. During the experiments, the relevant Cas9/gRNA vector was transformed into competent three strains (1D1249, EHA105, and C58C1) of Agrobacterium tumefaciens using heat shock method. Each strain was incubated in liquid LB medium with appropriate antibiotics at 200 rpm at 30°C one day before infiltration. Within the scope of the optimization study, two different selective marker genes (PDS and GFP), were transferred to tomato plants. In order to optimize agroinfiltration protocol, initially, different growth periods of tomato seedlings were assessed and our results showed that the 4th and 5th weeks were the most suitable period for transformation. After different OD600 trials, it was seen that the best result was obtained with 0.8 OD value. The prepared MES infiltration buffer was applied to the leaves with 1 ml sterile syringes and approximately 0.3-0.5 ml was infiltrated in each application. When all these experiments were optimized, the desired albino phenotype was achieved in PDS-silenced tomato leaves. Subsequently, agroinfiltration with GFP selective marker gene also showed green glow in the image taken under UV as expected while no glow was observed in the unfiltrated negative control plant. The optimized protocol could be used to fasten in planta gene editing studies in tomato.