Hepatosellüler karsinomada SIP1'in protein etkileşimlerinin ve ifadesini düzenlediği genlerin tanımlanması

Abstract

Hepatoselüler karsinoma (HCC) karaciğerin en sık görülen primer malignitesi olup tüm dünyada kansere-bağlı ölümlerde ikinci sırada yer almaktadır. Kansere bağlı ölümlerde metastaz en önemli ölüm nedenidir. Normal embriyo gelişiminde rol oynayan epitel-mezenkim geçişi (EMT) epitelyal tümörlerin invazyon ve metastazında önemli rol alır. E-box dizilerine bağlanarak E-kaderini baskılayan EMT düzenleyicilerinden ZEB2 (SIP1)'nin ayrıca hücre döngüsü, hücre yaşlanması ve mikroRNA'ların karşılıklı düzenlenmesi gibi süreçlerde rol oynadığı bilinmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda, ZEB2 tarafından transkripsiyonel regülasyonu gerçekleştirilen az sayıda hedef gen tanımlanmıştır. Bu çalışmada, ZEB2 tarafından düzenlenen biyolojik süreçlerin çeşitliliği ve genomda çok sayıda E-box varlığından hareketle, endojen ZEB2 anlatımı yüksek SNU398 HCC hücre hattında ZEB2 hedef genleri kromatin-immünopresipitasyon sonrası yeni nesil dizilemeyle (ChIP-seq) belirlendi. ChIP-dizileme analizi sonucunda 509 gen tanımlandı. Hedef genom bölgelerinin analizleri ilk olarak, ZEB2'nin baskılandığı SNU398 ZEB2-shRNA klonlarında yapıldı. İfade değişimi belirlenen MAP7, BOK ve GALNT3'ün ChIP-DNA'larında ZEB2'nin bağlandığı bölgenin zenginleşmesi belirlendi. Hem gen anlatımında hem de kromatin zenginleşmesinde en yüksek değişim ZEB2 ile negatif korelasyon gösteren GALNT3 geninde belirlendi. Çalışmalara proteinlerin glikolizasyonunda rol alan PolypeptideN-Acetylgalactosaminyltransferase ailesi üyesi GALNT3 ile devam edildi. ZEB2 anlatımının arttırıldığı kolon kanseri hücre hattında da GALNT3 gen ve protein ifade değişimlerinin gösterilmesi sonrasında in vivo analizler yapıldı. İnsan kanser örneklerinde ZEB2 ve GALNT3'ün normal dokulara göre tümörlerdeki anlatımları in vivo örnekler ve in silico analizlerde değerlendirildi. İn-vitro koşullarda elde edilen değerlendirmelerin in vivo değerlendirmeler için de geçerli olduğu ve iki gen arasında ters korelasyon bulunduğu tespit edildi. Sonuç olarak, ZEB2'nin glikozilasyonda görevli GALNT3 enziminin transkripsiyonel regülasyonunda rol aldığının belirlenmesi, EMT ve kanser metastazının oldukça kompleks yapısına dikkat çekmektedir.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent primary malignancy of the liver and the second leading cause of cancer-related deaths worldwide. Tumor invasion and metastasis are the most prominent cause of cancer-related deaths and are regulated by a molecular program, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), which is active during normal embryogenic development. ZEB2 (SIP1) is among EMT regulators that downregulate E-cadherin by binding to E-box sequences and is also involved in cell cycle, cellular senescence reciprocal regulation of micro RNAs. Only a few genes regulated by ZEB2 were described so far. Given the multiplicity of biological processes regulated by ZEB2 and the presence of myriad of E-boxes in the genome, we aimed in this study to identify ZEB2 target genes in a HCC cell line, SNU398 with high endogenous ZEB2 expression, by home-made monoclonal antidody-based chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq). A total of 509 genes were detected by ChIP-Seq. The analyses of target genome regions were first performed in ZEB2-shRNA and control clones of SNU398 cells. Differentially expressed genes MAP7, BOK and GALNT3 also displayed significant fold enrichment in ChIP assay. The most significant change in ZEB2-dependent gene expression and ChIP fold-enrichment was found for GALNT3 gene, which shows negative correlation with ZEB2. GALNT3 is a member of the Polypeptide N-Acetylgalactosaminyltransferase family of enzymes that glycosylate proteins and was selected in this thesis work for further studies. In vivo analyses were performed after the demonstration of ZEB2-dependent changes in gene and protein expression of GALNT3 in the ZEB2-inducible colorectal cancer cancer cell line. Expression of ZEB2 and GALNT3 in human cancer samples was assessed in tumor cDNA arrays and in silico analyzes. Our in vitro observation that ZEB2 and GALNT3 are inversely correlated was validated in in vivo studies. In conclusion, our findings that reveal the role of ZEB2 in the transcriptional regulation of GALNT3, an enzyme that mediates glycosylation of proteins, point out to the complexity of EMT and cancer metastasis processes.