P53 geninin nokta mutasyonunu sentetik oligonükleotit kullanarak tespit edebilen optik tabanlı DNA biyosensörünün geliştirilmesi

Abstract

Bu çalışmada prizma çiftleyici DNA hibritleşmesini doğrudan (etiketsiz) algılamak amacıyla kullanılmıştır. Prizma çiftleyici ince dielektrik filmlerin kırınım indislerini yüksek doğruluk payı ile ölçen bir alettir. Bu da prizma çiftleyiciyi film yüzeyine DNA immobilize olması ya da film yüzeyinde DNA hibritleşmesi sonucu meydana gelen ufak kırınım indisi değişimlerinin algılanması için uygun kılar. SiO2 ? TiO2 imce filmleri cam altlıklara dalga kılavuzu özelliğine ve DNA immobilize edilebilicek kimyada bir yüzeye sahip bir tabaka oluşturmak amacıyla sol-jel daldırarak kaplama yöntemiyle elde edilmiştir. 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) kaplama yüzeyine uygulanarak tek tabaka oluşması amaçlanmıştır. Daha sonra bu tek tabakanın üzerine çapraz bağlayıcı görevi görecek olan 1,4 phenylene diisothiocyanate (PDC) uygulanmıştır. PDC bir yanından APTES tabakasında bulunan amin gruplarına diğer yanından prob oligonükleotitlerde bulunan amin gruplarına bağlanarak immobilizasyonu C-N bağları aracılığıyla gerçekleşmesini sağlaması beklenmektedir. Hibritleşme işlemleri 80°C ve 45 °C sıcaklıklarda gerçekleştirilmiştir. Ayrıca analit oligonükleotitlerin içinde bulunduğu çözelti de değiştirilerek etkisi incelenmiştir. Prizma çiftleyici ile prob oligonükleotit immobilizasyonundan önce, prob oligonükleotit immobilizasyonundan sonra ve yüzeye analit uygulanmasından sonra ölçüm alınmıştır. Bu deneylerle karşılaştırmak amacıyla Flüoresan Mikroskobu ile de görüntüler her deneyden sonra alınmıştır.In this study, prism coupler is introduced as a label free optical detection method of DNA hybridization. Prism coupler possesses the ability to measure the refractive index of thin dielectric films with high accuracy. This makes it very suitable to measure the minute changes in the refractive index caused by the immobilization and hybridization of oligonucleotides. SiO2 ? TiO2 thin films were deposited onto glass substrates by a sol-gel method to obtain a layer with a good waveguide property (for proper prism coupler measurement), a suitable surface chemistry (oligonucleotide immobilization), and a porous surface (high surface area to increase the number of available sites for immobilization). The chemical analyses of the films were made with FTIR and the surface morphology of the films were observed with SEM. 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) was applied to the thin film surface and self assembled monolayers were formed by the bonding of Si atoms available in APTES and hydroxyl groups available on the thin film surface. 1,4 phenylene diisothiocyanate (PDC) was used as a homobifunctional crosslinker to immobilize the probe oligonucleotides on the surface. Amine groups available in the amino ? modified probe oligonucleotides and APTES form a covalent bond with the carbon atoms at both ends of the crosslinker PDC. Hybridization procedures are carried out at 80°C (a temperature close to the melting temperature of the oligonucleotide) and at 45°C. Refractive index measurements are taken by using a prism coupler before probe oligonucleotide immobilization, after probe DNA immobilization and after hybridization. The solution which contained the target oligonucleotites were also switched from water to HEPES buffer solution to observe the difference. The samples were observed with a Fluorescence Microscope to compare with the Prism Coupler Results.