Farklı ayçiçeği genotiplerinde crıspr/cas9 metodu kullanılarak oleik asit miktarı değiştirme çalışmaları

Abstract

Ayçiçeği (Helianthus annuus L.), yağ, protein ve enerji kaynağı olarak büyük potansiyele sahip olması nedeniyle dünyanın değerli bitkileri arasındadır. Son yıllarda, yağlı tohumlara sahip olması dünya pazarındaki değerini oldukça artırmıştır ve bitkisel yağ üretiminde soya fasulyesinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Omega-6 yağ asidi desatürazı (FAD2), omega-9 oleik asidi omega-6 linoleik öncüllere dönüştüren bir enzimdir. Bu çalışmada Agrobacterium aracılı transformasyon sistemi ve CRISPR/Cas9 gen düzeltme metodu ile oleik asit miktarı az olan (9728-B ve 97251-B) iki farklı ayçiçeği genotipinde FAD2-1 geninin susturulması hedeflenmiştir. Bitki doku kültürü optimizasyonlarından sonra, 9728-B bitkisinin rejenerasyon oranı düşük olduğundan 97251-B genotipi ile çalışmalara devam edilmiştir. Agrobacterium aracılı transformasyon sisteminin protokolünü optimize etmek için ayçiçeği bitkisinin PSY (fitoen sentaz) geninde CRISPR/Cas9 genom düzeltme yöntemi kullanılarak yapılacak olan mutasyon ile bitkilerin albino yapılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda ayçiçeği embriyolarına söz konusu transformasyonun ardından rejenere olan bitkilere aktarılmış olan vektörde bulunan kanamisin direnç geninin PZR yöntemi ile çoğaltılması sonucu transformasyon doğrulanmıştır. Ayrıca T-DNA bölgesinden ve T-DNA bölgesinin dışından primeler seçilip ikinci bir transformasyon doğrulaması yapılmıştır. Bunu takiben ayçiçeğinde oleik asit miktarının arttırılması için, FAD2-1 genini hedef alarak mutasyon oluşumunu sağlayacak olan kaset, aynı transformasyon yöntemi kullanılarak ayçiçeği embriyolarına aktarılmış ve aynı doğrulama yöntemleri kullanılarak transformasyon doğrulanmıştır. Mutasyon çalışmalarında gen dizilerinde mutasyon görülmese de ayçiçeklerinin transforme olduğu gösterilmiştir. PSY geni çalışmalarında transformasyon oranı %78,5 olarak bulunurken, FAD2-1 geni çalışmalarında ise deney grubu 1'de (10 dakika vakum infiltrasyonu uygulanan örnekler) transformasyon oranı %93,33, deney grubu 2'de (15 dakika vakum infiltrasyonu uygulanan örnekler) transformasyon oranı %86,6 olarak belirlendi.Sunflower (Helianthus annuus L.) is among the valuable plants of the world because of its great potential as a source of oil, protein and energy. Sunflower has oil seeds. For this reason, the value of sunflower in the world market has increased considerably in recent years. It ranks second after soybean in vegetable oil production. Omega-6 fatty acid desaturase (FAD2) is an enzyme that converts omega-9 oleic acid to omega-6 linoleic precursors. In this study, it was aimed to silence the FAD2-1 gen in two different sunflower genotypes (9728-B and 97251-B) with low oleic acid content by Agrobacterium-mediated transformation system and CRISPR/Cas9 gene editing method. After the plant tissue culture optimizations, studies were continued with the 97251-B genotype because the regeneration rate of the 9728-B plant was low. First, mutation was targeted in the sunflower plant PSY (phytoene synthase) gene using the CRISPR/Cas9 method to optimize the protocol of the Agrobacterium-mediated transformation system. Mutation in the PSY gene makes plants of the albino phenotype. PCR was performed using kanamycin resistance gene primers to confirm transformation in sunflower embryos. In addition, a second transformation validation was performed by selecting primes from the T-DNA region and outside the T-DNA region. Subsequently, in order to increase the amount of oleic acid in sunflower, the cassette, which will cause mutation by targeting the FAD2-1 gene, was transferred to sunflower embryos using the same transformation method and the transformation was confirmed using the same validation methods. Although no mutations were observed in gene sequences in mutation studies, sunflowers were shown to be transformed. Transformation rate was 78.5% in PSY gene studies. In the studies of the FAD2-1 gene, the transformation rate was 93.33% in experimental group 1 (10 minutes vacuum infiltration applied samples) and 86.6% in experimental group 2 (15 minutes vacuum infiltration applied samples).