Analysis of structural changes in Cryptocrome protein by fluorescence energy transfer (FRET)

Abstract

Floresan rezonans enerji transferi (FRET) analizi, moleküler biyolojide proteinlerin konformasyonel değişiklikleri de dahil olmak üzere moleküler dinamikleri araştırmak için kullanılan bir yöntemdir. FRET, floresan verici ve alıcı tarafından yayılan enerjideki değişiklikler ölçülerek analiz edilebilir. Drosophila Cryptochrome (DmCRY), mavi ışığa duyarlı bir flavoproteindir ve sirkadiyen saatin sıfırlanması için fotoreseptör olarak işlev görür. Işığa maruz kaldıktan sonra, DmCRY, sirkadiyen saatin sıfırlanması için gerekli sinyali başlatmak ve sonrasında kendi yıkılımı aktive etmek için Timeless, Jetlag ve BRWD3 proteinlerine bağlanmasına izin veren bir yapısal değişikliğe uğrar. Bu tezin amacı, DmCRY'deki yapısal değişikliğin FRET tekniğiyle tespitinin olasılığını belirlemektir. Bu amaçla, DmCRY sırasıyla N- ve C-terminallerinde Clover ve mRuby2 floresan proteinlerine kaynaştırıldı ve bakterilerde ifade edildi. 6xHis etiketine sahip rekombinant proteinler, nikel boncuklar kullanılarak saflaştırıldı. FRET, saflaştırılmış Clover-DmCRY, DmCRY-mRuby2 ve Clover-DmCRY-mRuby2 proteinlerinin floresan spektrumları alınarak analiz edildi. Bununla birlikte, rekombinant proteinlerin FAD içeriğinin çoğu, bakterilerden arındırma sırasında kayboldu. Her ne kadar sistemimiz Clover'dan mRuby2'ye bir enerji transferi gösterse de, Clover-DmCRY-mRuby2 proteini ışığa maruz kaldığında FRET verimliliğinde herhangi bir fark gözlemlemedik, bu da ışığa bağlı konformasyonel değişimi ölçmemizi engelledi. Genel olarak, bu çalışma Clover-DmCRY-mRuby2'deki FRET verimsizliğinin, sitokiyometrik FAD içeriğine sahip saflaştırılmış proteini elde etmek için optimizasyon ile artırılabileceğini, çünkü düşük FAD içeriğinin saflaştırılmış rekombinant proteinin uygun katlanmasını engellediğini göstermiştir.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis is a method used in molecular biology to investigate molecular dynamics including conformational changes of proteins. FRET can be analyzed by measuring changes in the energy emitted by the fluorescent donor and acceptor. Drosophila Cryptochrome (DmCRY) is a blue light sensitive flavoprotein and functions as a photoreceptor for the resetting of the circadian clock. After exposure to light, DmCRY undergoes a conformational change that allows it to bind to Timeless, Jetlag, and BRWD3 proteins, which starts the signaling cascade for the resetting and degradation of DmCRY itself. The aim of this thesis is to determine the conformational change in DmCRY by FRET analysis. For this purpose, DmCRY was fused to Clover and mRuby2 fluorescent proteins at the N- and C-termini, respectively and expressed in bacteria. Recombinant proteins with 6xHis tag were purified using nickel beads. The FRET was analyzed by taking fluorescence spectra of purified Clover-DmCRY, DmCRY-mRuby2, and Clover-DmCRY-mRuby2 protein. However, most of the FAD content of recombinant proteins was lost during purification from bacteria. Even though, our system showed an energy transfer from Clover to mRuby2, but we could not observe any difference at the FRET efficiency when the Clover-DmCRY-mRuby2 protein was exposed to light, which indicated that we could not measure light-dependent conformational change. Overall, this study suggested that FRET inefficiency in Clover-DmCRY-mRuby2 could be increased by optimization to get the purified protein with stoichiometric FAD content because low FAD content impair the proper folding of the purified recombinant protein.