Bacillus soylarından lipaz/esteraz genlerinin klonlanması ve rekombinant enzimlerin üretimi

Abstract

Lipazlar yağ/su ara yüzeyindeki trigliseritİeri hidroliz etme yeteneğindeki bir grup enzimden oluşmakta, biyoteknolojik uygulamalara yönelik yüksek potansiyelleri nedeniyle son yıllarda çok ilgi çekmektedirler. Lipazlar çeşitli küf ve bakteriler tarafından kültür ortamına salınmakta olup, endüstriyel uygulamalar için yeni özellikler taşıyan lipazlar tanımlanmakta, klonlanmakta, safaştırılarak ayrıntılı olarak nitelendirilmektedir. \"Bacillus soylarmdan Lipaz/Esteraz Genlerinin Klonlanması ve Rekombinant Enzimlerin Üretimi\" başlıklı projenin temel hedefleri, lipolitik enzim genlerinin bilinen ve yeni izole edilen Bacillus soylarmdan hareketle klonlanması, ekspresyonu ve ilgili enzimlerin nitelendirilmesi ve üretilmesidir. Proje kapsamında bu raporda aktarılan çalışmalar; GYTE Moleküler Biyoloji AD Enzim Moleküler Genetiği ve Kızılay Pendik Tıp Merkezi Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada lipaz üreticisi Bacillus soyları yerel ekosistemlerden taranarak seçilmiştir. Morfolojik ve biyokimyasal tiplendirmeleri yapılan soylar tür düzeyinde adlandırılmıştır. Buna göre izolatların önemli bir bölümü B. subtiks/B. pumilus/B. firmus olarak tanımlanmıştır. Üretken soyların büyüme eğrileri hazırlanarak, enzimatik aktiviteleri değerlendirilmiştir. Seçilmiş soylardan 4 tanesinden sınırlandırılmış gen kütüphaneleri hazırlanmış, bilmen lipaz gen dizilimleri gözetilerek hazırlanan dejenere primer yardımıyla taranmıştır. Klon adayı 3 koloninin enzim üretkenliği değerlendirilmiştir. 3 klon adayı alt klonlama ve ekspresyon çalışmalarına alınacak, rekombinant soylardan enzim saflaştırma ve nitelendirme çalışmaları yapılacaktır. Proje kapsamında seçilerek tiplendirilen yerel soylardan Bacillus GIT-L15 tarafından besi yerine salgılanan lipaz enzimi, kültür üst sıvısından saflaştırılmış ve nitelendirme çalışmalarına alınmıştır. Bulgularımız Bacillus GIT-L15 lipazınm bu güne değin rapor edilen en düşük moleküler ağırlıklı (yaklaşık 11 kDa) lipaz olduğuna işaret etmektedir. Saflaştırılan GIT-L15 lipazınm optimal reaksiyon sıcaklığı 40°C ve optimal pH değeri 9.0 bulunmuştur. Enzimin 45°C'ta, başlanıç aktivitesinin % 67'sini, 50°C'ta ise % 44'ünü koruduğu gözlenmiştir. Saf enzim en yüksek kararlılığı pH 7.5'da göstermiş, pH, 7.5-9.5 aralığmdaki kararlılığı % 100 ile % 72 arasında bulunmuştur. EDTA'mn aktivite üzerindeki etkisi sınırlı olduğundan GIT-L15 lipazmın bir metalloenzim olmadığı ve aktivite PMSF ile büyük oranda inhibe olduğundan, enzimin aktif bölgesinde bir serin rezidüsü taşıdığı sonucuna varılmıştır. SDS, Tween 80 ve CTAB varlığında azalan enzim aktivitesi, Triton X-100 ve sodyum deoksikolat varlığında yükselmiştir. % 10-30 gliserol, EG ve DMSO varlığında enzimin 50°C'taki sıcaklık kararlılığı önemli derecede artmıştır. Saf enzimin aktivitesinin B-ME ve DTT varlığında kısmen yükseldiği bulunmuştur. Bacillus GIT-L15 lipazı pH optimali (9.0), Triton X-100, deoksikolat, metanol, izopropanol ve DMSO varlığındaki aktivasyonu, 50°C'ta gliserol, EG ve DMSO varlığında 18 keze kadar artabilen kararlılığı ve 20°C'taki yüksek aktivitesi ile çeşitli biyokataliz süreçlerinde ve deterjan formulasyonlannda denenebilecek bir enzim olarak görünmektedir. Klasik tiplendirme yöntemlerine ek olarak 16S rDNA dizi analizinden elde edilen veriler, Bacillus GIT-L15'in bir B. pumilis soyu olabileceğine işaret etmiştir. Başta Bacillus GIT-L15 soyu olmak üzere, seçilen yerel soylar ve geliştirilecek rekombinant soyların biyoteknolojik süreçlerde kullanılma potansiyeli değerlendirilecektir.