Development of a novel exo-polygalacturonase for agricultural applications

Abstract

Poligalakturonazlar pektin substratlarını parçalayan bir grup enzimlerdir. Yağ ekstraksiyonu, fermente içecek üretimi, meyve suyu durultması ve atık suların giderilmesinde poligalakturonazlar kullanılmaktadır. Bu çalışmada Sporothrix schenckii 1099-18 mikroorganizmasından elde edilen yeni bir ekzo-poligalakturonaz enziminin heterolog ifadesi, saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu, hesapsal modellemesi ve elma suyunu durulma performansı değerlendirilmiştir. Çalışmada biri alfa sinyal sekansına sahip olan diğeri ise SsExo-PG'e ait sinyal sekansına sahip olan iki farklı pPIC9K tasarlanmıştır. Uygun sinyal dizisi içeren plazmid Pichia pastoris'e transforme edildi ve protein üretimi ile protein saflaştırması gerçekleştirilmiştir. Biyokimyasal ve yapısal analizler saf SsExo-PG ile gerçekleştirilmiştir. SsExo-PG saflaştırılması Ni-NTA kromotografi sistemi kullanılarak yapılmıştır. Enzimin molekül ağırlığı yaklaşık 52 kDa olarak belirlenmiştir. SsExo-PG depo kararlılığı olarak 8 haftaya kadar oda sıcaklığı ve +4 °C'de enzimatik aktivitesinin %50'ye yakınını korumuştur. Yapısal analizler SsExo-PG'nin diğer Exo-PG'lere yapı olarak benzediğini ortaya çıkarmıştır. Cu+2 SsExo-PG aktivitesini attırırken Ag+2 ve Fe+2 enzim aktivitesinin nerdeyse tamamını inhibe etmiştir. Saflaştırılan enzimin poligalakturonik asite karşı KM ve kcat değerleri sırasıyla 0.5868 µM ve 179 s-1 olarak belirlenmiştir. SsExo-PG elma suyu berraklaştırma deneylerinde türbiditeyi %80 oranında azaltmıştır. Çalışmada kullanılan ticari pektinolitik enzim karışımları ile karşılaştırıldığında umut verici performans göstermiştir.Polygalacturonases are a group of enzymes under pectinolytic enzymes related to enzymes that hydrolyze pectic substances. Polygalacturonases have been used in various industrial applications such as juice clarification, retting of plant fibers, wastewater treatment, drinks fermentation, and oil extraction. The thesis was evaluated at the heterologous expression, purification, biochemical characterization, computational modeling, and performance in apple juice clarification of a new exo-polygalacturonase from Sporothrix schenckii 1099-18 in Pichia pastoris. Two different pPIC9K plasmids were constructed with native signal sequence-ssexo-pg and alpha signal sequence-ssexo-pg separately. Protein expression and purification performed after transformation of Pichia pastoris. Biochemical and structural analyses were performed by using purified enzyme. The optimum growth conditions for expression are induction with 1% methanol for 3 days at 30 °C. The purification of SsExo-PG was achieved by using Ni-NTA chromatography. The enzyme was found to have a molecular mass of approximately 52 kDa. The enzyme kept its activity about 50% at room temperature and +4 °C for 8 weeks. Structural analysis revealed that the catalytic residues of SsExo-PG are somewhat similar to other Exo-PGs. Cu2+ was found to enhance SsExo-PG activity while Ag2+ and Fe2+ almost completely inhibited enzyme activity. Kinetic properties of SsExo-PG were calculated against PGA and found 0.5868 µM and 179 s-1 for KM and kcat respectively. The enzyme reduced turbidity up to 80% thus enhanced the clarification of apple juice. SsExo-PG showed promising performance when compared with other commercial pectinolytic enzyme mixtures.