The interaction of Elk-1 with kinesin motor protein in neurons

Abstract

Elk-1, transkripsiyon faktörlerinin ETS süper ailesinin alt ailesi olan Üçlü Kompleks Faktörlerinin bir üyesidir. Elk-1, MAPK yolağı üzerinden fosforillenerek aktive olur ve birçok önemli süreç içerisinde yer almaktadır. Nöronlarda Elk-1'in dendritlere ve akson terminallerine lokalize olduğu ve serum stimülasyonu üzerine çekirdeğe taşındığı bulunmuştur. Serum stimülasyonu sonrasında Elk-1'in nöronal mikrotübüllerle etkileşime girdiği gösterilmiştir. Ser-383'ten fosforile Elk-1, sitokinez boyunca ilk önce kutuplarda daha sonra orta cisimcikte lokalize olmaktadır. Elk-1'in mitoz boyunca kinesin ile kolokalize olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada, Elk-1'in kinesin motor protein ile etkileşip etkileşmediğini göstermeyi amaçladık. İlk olarak, Elk-1 ile etkileşebilecek olası kinesinleri biyoinformatik yaklaşımları kullanarak belirledik. Elk-1 ve bu KIF'ler arasındaki etkileşimi araştırmak için immünopresipitasyon (IP) analizi yapılacaktı. IP'den önce, KIF'lerin hücrelerde aşırı ifadesi için, KIF'leri ekspresyon plazmidine klonlamayı denedik. Klonlamanın ilk adımı olarak KIF genlerinin amplifikasyonu için Gradyan PZR analizi gerçekleştirildi. Bu genlerin amplifikasyonu başarılı olamadığından, Elk-1'in ve fosfo-mutant formlarının daha önce laboratuvarımızda çalışılan Eg5 ile IP analizine devam ettik. Bunun yanı sıra, immünofloresan analizi ile Elk-1 ve Eg5'in kolokalizasyon çalışmalarını gerçekleştirdik. Bu analizler tamamlanamadığı için, hücre hattı ve Elk- 1'in fosfo-mutant formları değiştirildi. İleriki analizlere başlamadan önce, bu mutantların ekspresyonlarını kontrol ettik. Buna göre Elk-1'in fosfomimik mutantı S198E, eksprese edilmiyor ya da hızla degrade oluyor. Bizim çalışmalarımız amaçlanan protein-protein etkileşimini tam olarak doğrulamasa da ileriki çalışmaların ve bu etkileşimin aydınlatılmasının tümör oluşum ve nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları için önemli olabileceğini düşünüyoruz.

Elk-1 is a member of Ternary Complex Factor (TCF) subfamily of the ETS superfamily of transcription factors. Elk-1 is activated through phosphorylation upon MAPK pathway and participates in many important cellular processes. In neurons, Elk-1 was found to localize to dendrites and axon terminals, and upon serum stimulation, it relocates to the nucleus. It was shown that Elk-1 interacts with neuronal microtubules after serum stimulation. Phosphorylated Elk-1 from Ser-383 is localized firstly in spindle poles, then midbody during cytokinesis. Elk-1 was found to colocalize with kinesin during mitosis. In this study, we aimed to demonstrate whether Elk-1 could interact with kinesin motor protein in neurons. We firstly identified possible kinesins that could interact with Elk-1 using bioinformatic approaches. To investigate interaction between Elk-1 and these KIFs, immunoprecipitation analysis (IP) would be performed. Before IP, for overexpression of KIFs, we tried to clone them into expression plasmid. As the first step of cloning Gradient PCR analysis was performed for amplification of KIF genes. Since amplification of these genes could not be achieved, we continued with IP analysis of Elk-1 and its phospho-mutant forms with Eg5 that was studied before our laboratory. On the other hand, we have conducted co-localization studies of Elk-1 and Eg5 with immunofluorescence analysis. Due to not accomplish these analyses, cell line and phospho-mutant forms of Elk-1 were changed. Before starting the further analysis, we checked expressions of these mutants, and phosphomimic mutant of Elk-1, S198E was either not expressed or rapidly degraded. Although our studies did not clearly confirm protein-protein interactions aimed in the thesis, we believe that further studies and elucidation of this interaction may be important for mechanisms of tumor formation and neurodegenerative diseases.