Aşırı DEK2 izoformu ifadesinin HS-27A hücre biyolojisine etkilerinin araştırılması

Abstract

DEK proteini DNA tamiri dahil birçok hücresel süreçte yer alan ve bazı solid kanser türlerinde aşırı ifade gösteren bir onkoproteindir. DEK geni, alternatif kırpılmayla iki farklı DEK izoformunu kodlamaktadır. DEK izoform-1 (DEK1) hücresel süreçlerdeki rolü araştırılsa bile, DEK izoform-2 (DEK2) detaylı olarak incelenmemiştir Tez kapsamında, HS-27A hücrelerinde retroviral transdüksiyon yöntemiyle, N-terminal bölgesine Myc ya da Flag epitopu eklenmiş DEK1 ve DEK2 proteinlerinin kalıcı aşırı ifadesi sağlandı. Protein lokalizayon analizi, DEK1'in çekirdekte konumladığı, DEK2'ninse çekirdeğe ek olarak bu hücrelerin yaklaşık %90'nında Nucleophosmin-1 ile örtüşen agregatlar oluşturduğunu gösterdi. Bu hücrelerde doxorubicin ile DNA hasarı oluşturuldu. HS-27A MycDEK1 veya MycDEK2 hücrelerinin kontrol (HS-27A-GFP) hücrelerinden daha fazla gamma-H2AX DNA hasar sinyali oluşturduğu belirlendi. Ancak, doxorubicin uzaklaştırıldıktan 24 saat sonra DEK2 hücrelerindeki DNA hasar seviyesinin kontrol ve DEK1 hücrelerine göre daha yüksek seviyede olduğu tespit edildi (p<0,05). RT-qPCR analiz sonuçları, DEK2'nin düşük seviyede olmakla birlikte farklı hücrelerde ifade edildiğini gösterdi. Meme, kolon, akciğer, tiroid, karaciğer, over, prostat ve böbrek gibi farklı kanser türlerinde (normal n=3, tümör n=9) DEK1 ve DEK2 seviyesi analiz edildi. Normal dokuya kıyasla, DEK1 ifadesi meme kanserinde ortalama 137 kat, kolon kanserinde ise ortalama 24 kat artış gösterdi (p<0,05). DEK2 ifadesiyse bu tümör dokularında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde farklılık göstermedi. Elde ettiğimiz sonuçlar; DEK2'nin DEK1 den farklı olarak çoğunlukla çekirdekçikte lokalize olduğunu; indüklenen çift iplikli DNA hasarının DEK2 hücrelerinde daha uzun süre tamir edilmeden kaldığını; normal veya tümör dokularında DEK1 ve DEK2 ifade seviyesinin dokuya göre farklılık gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu tez çalışması TÜBİTAK tarafından KBAG 118Z765 numaralı 1001 projesi ile desteklenmiştir.DEK protein is an oncoprotein involved in many cellular processes, including DNA repair and overexpressed in some solid cancers. DEK gene encodes two different DEK isoforms by alternative splicing. Although DEK isoform-1 (DEK1) in cellular processes has been investigated, DEK isoform-2 (DEK2) has not been studied in detail. In this thesis, persistent overexpression of DEK1 and DEK2 proteins with a Myc or Flag epitope at the N-terminus were expressed by the retroviral method in HS-27A cells. DEK1 and DEK2 protein location was found in nucleus, but DEK2 protein also in nucleolus by overlapping Nucleophosmin-1 in approximately 90% cells. Doxorubicin induced DNA damage analysis showed that DEK1 and DEK2 cells produced more gamma-H2AX DNA damage signals than control cells. However, 24 hours after doxorubicin removal, DEK2 cells showed higher signal than control and DEK1 cells (p<0.05). RT-qPCR analysis showed low level of DEK2 expression in different cells. Breast, colon, lung, thyroid, liver, ovarian, prostate and kidney tissues were analysed to DEK1 and DEK2 expression in cancer (normal n=3, tumor n=9). Compared to normal tissue, DEK1 level increased 137-fold in breast cancer and 24-fold in colon cancer (p<0.05). Whereas no statistically significant difference at DEK2 expression was found. Our results show that; DEK2 is mostly localized in the nucleolus, unlike DEK1; DNA damage remain unrepaired for longer in DEK2 cells; expression level of DEK1 and DEK2 can be differ in normal or tumor tissues. This study was supported by the Scientific and Technological Research Council of Turkey (TÜBİTAK) 1001 Grant (KBAG 118Z765).