VIGS tabanlı STTM yaklaşımıyla mısır (Zea mays) yaprağının soğuk stresine verdiği yanıtta ZMA-miR408 ve hedeflediği genlerin işlevlerinin araştırılması

Abstract

miR408, bir çok bitkide bakır (Cu) metabolizmasında yer alan genleri düzenlediği bilinen korunmuş bir bitki mikro RNA (miRNA) ailesidir. Bununla birlikte, miR408'in soğuk stresi altında mısır yaprağı büyüme ve gelişiminin düzenlemesindeki işlevi tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, endojen zma-miR408, kısa ardışık hedef taklit (STTM) ve Virüsle indüklenmiş gen susturma (VIGS) yaklaşımları birlikte kullanılarak geçici olarak susturulmuştur. Bu amaçla, STTM-miR408a/b tasarlanmış, sentezlenmiş ve Brome mozaik virüsü (BMV) tabanlı bir vektöre klonlanmıştır. Ardından bu vektör, agroinfiltrasyon ile Nicotiana benthamiana ara konakçı bitkisinde çoğaltılmasının ardından elde edilen floem öz suyu ile mısır fidelerine yaprak uçlarından uygulanmıştır. Daha sonra, STTM-miR408a/b ve boş vektör ile muamele edilen ve sırasıyla STTM ve BV olarak adlandırılan deney ve kontrol gruplarında yetiştirilen fideler soğuk stresine (S) maruz bırakılmış ve fidelerin büyüme tepkisi morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal ve transkripsiyonel seviyede incelenmiştir. Sonuç olarak, STTM-miR408a/b muamelesinin endojen mir408a/b ifadesini başarılı bir şekilde susturduğu tespit edilmiştir. Buna karşın, in silico analizler ile tahmin edilmiş zma-miR408a/b hedefleri olan Basic blue protein (BBP) ve Blue copper protein (BCP) ifadelerinin, STTM ve STTMS gruplarında BV ve BVS gruplarına kıyasla antagonistik olarak düzenlendiği ve transkripsiyon seviyelerinin arttığı saptanmıştır. Öte yandan, miR408'in varsayılan hedefi olan Lakkaz (LAC22) geni STTM grubunda BV grubuna kıyasla ifadesi artarken, BVS ve STTMS grupları arasında önemli bir fark ortaya çıkmamıştır. STTM-miR408a/b muamelesi mısır bitkisinin ikinci ve üçüncü yapraklarının uzama oranı (YUO)'nda sırasıyla %10 ve %19 azalışa neden olmuştur. Ayrıca, Katalaz (CAT) ve Glutatyon redüktaz (GR) aktivitesi STTM, BVS ve STTMS gruplarında %57 oranında, BVS ve STTMS gruplarında ise sırasıyla %29 ve %28 oranında azalırken, Askorbat peroksidaz (APX) BVS ve STTMS gruplarında %15 oranında artmıştır. Bu bulgular, miR408'in, hedeflediği BBP, BCP ve LAC genlerinin ifadesini ve dolaylı olarak antioksidan sistemi düzenleyerek mısır yaprağının soğuk stresi toleransı sırasında rol oynadığını göstermiştir.miR408 is a conserved plant micro RNA (miRNA) family that is known to regulate genes involved in copper metabolism. However, the function of miR408 in maize leaf growth regulation and development under cold stress isn't defined. In this study, endogenous maize zma-miR408 was transiently silenced by using Virus-induced gene silencing (VIGS) combined with Short tandem target mimic (STTM) approaches. To this end, STTM-miR408a/b was designed, synthesized, and cloned into a Brome mosaic virus (BMV)-based vector. It was agroinfiltrated into Nicotiana benthamiana as an intermediate host to amplification, collected with phloem sap and applied into the second leaf of maize seedlings. Subsequently, STTM-miR408a/b (STTM) and mock-treated (BV) seedlings were subjected to cold stress (S) and the growth response of the seedlings was monitored morphologically, physiologically, biochemically and transcriptionally. Finally, STTM-miR408a/b-treatment successfully downregulated the expression of endogenous mir408a/b and upregulated their putative targets Basic blue protein (BBP) and Blue copper protein (BCP) antagonistically in the STTM and STTMS groups compared to BV and BVS groups. On the other hand, their putative target Laccase (LAC22) was upregulated in the STTM group compared to the BV group, but there were no significant expression differences between the BVS and STTMS groups. The elongation rate of the STTM-miR408a/b-treated second and third leaves was reduced by 10% and 19% resulting in 19% and 11% shortening, respectively. Furthermore, the activity of Catalase (CAT) and Glutathione reductase (GR) was decreased by 57% in STTM, BVS and STTMS groups and 29% and 28% in the BVS and STTMS groups and Ascorbate peroxidase (APX) was increased by 15% in BVS and STTMS groups, respectively. These findings illuminated miR408 role in the maize leaf growth response during cold stress tolerance via regulation of expression of BBP, BCP ve LAC genes and antioxidant system.