Chaetomium thermophilum format dehidrogenaz enzimi üzerine HIS-TAG uzantısının etkisinin araştırılması

Abstract

Enzimleri istenen miktarlarda elde etmek ve fonksiyonlarını incelemek için çeşitli protein ifade sistemleri kullanılabilir. Polihistidin etiketi eklemek, endüstriyel uygulamalar için FDH'ler gibi çeşitli enzimleri elde etmenin yararlı bir yoludur. Chaetomium thermophilum'dan (CtFDH) elde edilmiş olan NAD+ bağımlı format dehidrogenaz, NAD+'nın NADH'ye indirgenmesiyle birlikte formatın ve karbondioksite dönüştürülmesi için kullanılır. Bu çalışma, N-terminal Histidin etiketli CtFDH (N-CtFDH) ve C-terminal Histidin etiketli CtFDH (C-CtFDH)'ın, Histidin etiketinin konumunun enzimin etkinliği ve kinetik parametreleri üzerindeki etkisini öğrenmek için yapılmıştır. İlgili proteinlerin çözünürlüğü, etiket konumundan etkilenmemiş, ancak N-terminal bölgesindeki Histidin etiketi, sipesifik aktivitede ve enzimin kinetik yeteneğinde bozulmaya neden olmuştur. Elde edilen sonuçlar, enzimin C terminalinin polihistidin etiketi için uygun bölge olduğunu göstermiştir. C-CtFDH yaklaşık olarak N-CtFDH'den üç kat daha büyük özgül aktivite ve iki kat daha yüksek katalitik verimliliğe sahiptir. Sonuçlar, CtFDH'nin N-terminal veya C-terminal ucuna bir Histidin etiketinin eklenmesinin protein üzerinde farklı etkilere sahip olduğunu proteinin amino ucunun CtFDH'nin fonksiyonu için çok önemli olduğunu göstermektedir.

Several protein expression systems can be used to get enzymes in required quantities and study their functions. Incorporating a polyhistidine tag is a beneficial way of getting various enzymes such as FDHs for industrial applications. The NAD+ dependent formate dehydrogenase from Chaetomium thermophilum (CtFDH) can be utilized for interconversion of formate to carbon dioxide coupled with the conversion of NAD+ to NADH. In this study, N-terminal His tagged CtFDH (N-CtFDH) and C-terminal His tagged CtFDH (C-CtFDH) was constructed to learn the effect of His tag location on the activity and kinetic parameters of enzyme. The solubility of proteins was not affected by tag position, however, an interference on N-terminal region caused to a deterioration in specific activity and kinetic ability of enzyme. The obtained results indicated that the C-terminus of enzyme is appropriate region for tag engineering. The C-CtFDH has approx. three fold larger specific activity and two fold higher catalytic efficiency than N-CtFDH. The results suggest that insertion of a His-tag at the N-terminal or C-terminal end of CtFDH has different effects on the protein and the N-terminal fragment of protein is crucial for function of CtFDH.