Systematic analysis of the relationship between biological clock and cancer development

Abstract

Sirkadiyen saat, birçok biyokimyasal ve fizyolojik fonksiyonda günlük ritmi sağlamaktadır ve sirkadiyen saatin bozulması, obezite, diyabet, kalp hastalıkları ve kanser gelişim riskinin artması ile ilişkilendirilmektedir. Her ne kadar, Bmal1'ın karsinogenez üzerindeki rolü üzerine germline, koşullara bağlı ya da doku spesifik knockoutların kullanıldığı çalışmalar bulunsa da; BMAL1 geninin kansere bağlı biyolojik olayları moleküler seviyede nasıl etkilediği iyi anlaşılamamıştır. Diğer sirkadiyen saat gen knockoutların aksine; Bmal1, delesyonu tek başına tam bir ritim kaybına sebep olan tek gendir. Bu nedenle, CRISPR teknolojisi ile, insan meme epitel hücre hatlarında BMAL1 geni knockout edilerek, BMAL1 geninin bu moleküler mekanizmaya katkısının anlaşılması için in vitro bir yaklaşım alınması amaçlanmıştır. Pek çok kanser epitel hücrelerden kökenlendiğinden, fibroblastlar yerine epitel hücreler tercih edilmiştir. Tümörijenik olmayan MCF10A ve invaziv tümorijenik MDA-MB-231 hücrelerinde, BMAL1 geninin iki farklı bölgede hedeflenmesi ile BMAL1 knockoutların elde edilmesinden sonra, hücre hatlarının, tümör gelişiminde belirleyici olaylar olan apoptoz ve invazyon özellikleri analiz edilmiştir. BMAL1 hasarı, her iki hücre hattını da DNA adduct yapısı oluşturan ajan cisplatin ve çift iplik kırığı oluşumunu indükleyen doxorubicine'e duyarlı hale getirirken; MDA-MB-231 hücrelerinin invaziv özelliğini arttırmıştır. Bu sonuçlar, saat genlerinin bozulmasının, ters karsinojenik etkiler verebileceğini göstermektedir.The circadian clock confers daily rhythmicity on many biochemical and physiological functions and its disruption is associated with increased risks of developing obesity, diabetes, heart disease and cancer. Although, there are studies on the role of Bmal1 in carcinogenesis using germline, conditional or tissue-specific knockouts, how BMAL1 gene affects cancer-related biological events at the molecular level is not well understood. In contrast to other circadian clock gene knockouts, Bmal1 is the only gene whose deletion alone leads to complete loss of rhythmicity. Therefore, it was aimed to taken an in vitro approach to understand the contribution of BMAL1 in this molecular mechanism using human breast epithelial cell lines by knocking out BMAL1 gene with CRISPR technology. Epithelial cells were preferred over fibroblasts as the most of cancers originate from epithelial cells. After obtaining BMAL1 knockouts by targeting the gene at two different sites from non tumorigenic MCF10A and invasive tumorigenic MDA-MB-231 cells, apoptosis and invasion properties of the cell lines were analysed as representative events in tumor development. BMAL1 disruption sensitized both cell lines to a bulky-DNA adduct forming agent (cisplatin) and a double-strand break-inducing agent (doxorubicin), while it enhanced the invasive properties of MDA-MB-231 cells. These results show that the disruption of clock genes may have opposing carcinogenic effects.