Effect of active site mutations in nad+ dependent chaetomium thermophilum format dehydrogenase on conversion of carbon dioxide to formate

Abstract

Format dehidroegenazlar (FDH'ler), format iyonunu (HCOO-), karbondioksite (CO2) yükseltgerken, NAD+ iyonunun da NADH' e indirgenmesini katalize eden bir oksidoredüktaz grubu enzimleridir. NADH geleneksel kimyasal yöntemlerle üretilmesi pahalıdır. Bu nedenle FDH'ler, NADH'yi elde etmek amacıyla koenzim rejenerasyon sistemlerinde kullanılmaktadır. Ayrıca FDH'lerin ters reaksiyon ile karbon dioksiti formata indirgeyip, atmosferde ve okyanuslarda karbon fiksasyonu yapması umut verici başka bir uygulamadır. Bununla birlikte, yakın zamanda Chaetomium thermophilum format dehidrogenaz (CtFDH) enziminin CO2'nin formata indirgenmesi için yüksek aktiviteye sahip olduğu keşfedilmiştir. Bu reaksiyonun enzimde nasıl meydana geldiğini ortaya çıkarmak için, model sistemlerde CO2'nin enzimatik sabitlerinin incelenmesi gereklidir. Bu çalışmada, NAD+ bağımlı CtFDH enziminin katalitik bölgesine uygulanan spesifik mutasyonların, CO2'nin formata indirgendiği ters reaksiyon üzerindeki etkisini analiz etmek amaçlanmıştır. NAD+ bağımlı CtFDH'in aktif bölgesi üç mutasyon ile incelenmiştir. Tasarlanan mutasyonların enzim kinetik değerleri sırasıyla, yabanıl tip CtFDH ile karşılaştırılmıştır. En ilginç mutant enzim için ise moleküler dinamik hesaplamaları ile daha kapsamlı analizler yapılmıştır. CtFDH'in, aktif bölgesinde ve bu bölgeye yakın pozisyonlarda gerçekleştirilen iki mutasyon (Asn120Cys, Asn256Asp) ile enzimin format yükseltgeme aktivitesi kaybolurken, CO2 indirgeme aktivitesi korunmuştur. Ayrıca, diğer bir mutasyon (Asp283Asn) ise enzimin aktivitesinin her iki yönde de kaybolmasına neden olmuştur. Moleküler dinamik simülasyonlar, Asn120Cys mutasyonunun, lokal yapının değişmesine neden olduğunu göstermiştir. Böylece aktif bölgede daha fazla alanın oluşturulmasına olanak tanıyıp, hidrojen karbonatların açılan alanı doldurmasına izin vererek, reaksiyonun gerçekleşmesini sağladığı ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlar FDH'lerin aktif bölgesindeki yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında yeni bir anlayış yaratacaktır. Son olarak, bu çalışma, CO2 üzerinde aktif olan bir enzimin in vitro evrimi için yararlı bir teorik referans olacaktır.Formate dehydrogenases (FDHs) are a set of oxidoreductases that catalyze the oxidation of formate to carbon dioxide with the simultaneous reduction of NAD+ to NADH. Therefore, FDHs have been utilized in coenzyme regeneration systems that produce NADH which would be expensive to manufacture by conventional chemical synthesis. Another promising application of FDHs is carbon fixation from the atmosphere and the oceans using the reverse reaction, the reduction of carbon dioxide to formate. It has been recently discovered that the Chaetomium thermophilum formate dehydrogenase (CtFDH) enzymes also have high potential in the reverse direction, the reduction of aqueous CO2 to formate. Studying the enzymatic fixing of CO2 in model systems (e.g. formate dehydrogenases) is needed to reveal how this reaction happens in the enzyme. In this study, it is aimed to analyze especially how specific mutations can affect the reverse reaction from carbon dioxide to formate. The active site of NAD+-dependent Chaetomium thermophilum formate dehydrogenases was studied by three mutations. The kinetic values of the enzymes with the designed mutations were compared with the wild type CtFDH enzyme, respectively. In the comparisons the substrates were formate and sodium bicarbonate and the enzyme's cofactors were NAD+ and NADH. In CtFDH, two mutations that were close to the active site inactivated the enzyme for formate oxidation and retained the activity for hydrogen carbonate. Also, another mutation made the enzyme lose it's activity in both directions. It is highly likely that the enzyme-dependent structural changes in the active site are caused these differences in the acceptance of different substrates. The most interesting cmutant structure was further studied with the molecular dynamic calculations. The simulations also revealed a surprising possibility that the mutation Asn120Cys in CtFDH allows the local structure to change so that more space is created into the active site and then two hydrogen carbonates can fit there filling the open place and allowing the reaction to happen. The obtained results will generate new understanding about the structure-function relationships in the FDH active site. Lastly, this work will provide a helpful theoretical reference for the in vitro evolution of an enzyme active on CO2.