Immune profiling of the tumor microenvironment in a murine melanoma model treated with anti-TNF and immune checkpoint inhibitors via scRNA-seq

Abstract

Melanoma insidansı dünya genelinde artış göstermekte olup, ileri evre kutanöz melanoma önemli bir mortalite nedenidir. Programlanmış hücre ölümü reseptörü 1 (PD-1) ve sitotoksik T lenfosit ilişkili antijen 4 (CTLA-4) gibi immün kontrol noktası inhibitörleri (ICI) tedavileri kanser tedavisinde önemli bir ilerleme sağlamış olsa da, hastaların önemli bir kısmı bağışıklıkla ilişkili yan etkiler (irAE'ler) ve tedaviye karşı gelişen direnç mekanizmaları nedeniyle uzun vadede yeterli klinik yanıt alamamaktadır. Anti-Tümör Nekroz Faktör (anti-TNF) tedavisi, kolit gibi bazı irAE'leri etkili biçimde kontrol altına alabilmekte ve bazı fare tümör modellerinde ICI tedavisinin etkinliğini artırabilmektedir. Bu durum, anti-TNF tedavisinin ICI ile kombinasyonunun hem tümör yanıtını artırabileceğini hem de toksisiteyi azaltabileceğini düşündürmektedir. Ancak, bu kombinasyonun farmakodinamik etkileri henüz yeterince aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada, B16-OVA melanoma fare modeli kullanılarak tümör mikroçevresindeki bağışıklık hücrelerinin tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) yöntemiyle kapsamlı analizi gerçekleştirilmiştir. CD45? tümör infiltre eden lökositler incelenmiş ve iki farklı tedavi rejimi karşılaştırılmıştır: (1) anti-PD-1 ve anti-CTLA-4'ü içeren biterapi ve (2) bu rejime ek olarak anti-TNF içeren triterapi. Biyoinformatik analiz süreci; veri ön işleme, hücre tipi anotasyonu, hücre tipi miktarlarının karşılaştırılması, farklı şekilde eksprese edilen genlerin (DEG) belirlenmesi, gen seti zenginleştirme ve aşırı temsil analizi (ORA) ve hücreler arası etkileşim analizlerini kapsamaktadır. Analizler sonucunda, anti-TNF tedavisinin düzenleyici T hücreleri (Treg) ve doğal öldürücü hücreler (NK) popülasyonlarını anlamlı ölçüde azalttığı saptanmıştır. Ancak bu hücre popülasyonlarında tedaviler arasında sınırlı sayıda farklı gen ifadesi gözlenmiş, bu da anti-TNF'nin hücre miktarları üzerinde etkili olduğunu, gen ekspresyon profillerini doğrudan değiştirmediğini düşündürmektedir. Hücreler arası etkileşim analizinde, biterapi grubunda CD8? T hücreleri ile Treg'ler arasında CCL3–CCR4/CCR5 ekseninde bir etkileşim saptanmış, bu durum biterapi örneklerindeki Treg hücresi fazlalığının kemokin aracılı çekilme yoluyla gerçekleştiğini düşündürmektedir. Ayrıca, biterapi grubundaki CD8? T hücrelerinin daha belirgin bir efektör profile sahip olduğu ve bu hücreler içinde belirli bir alt grubun tedaviden en fazla etkilendiği belirlenmiştir. Bu alt popülasyonda, biterapi rejimi altında TNFR1 aracılı sinyal iletimi ve apoptozla ilişkili yolakların zenginleştiği; buna karşın triterapi grubundaki CD8? hücrelerde proliferatif aktivitenin arttığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular, TNF varlığının uzun süreli deneysel süreçte bazı CD8? alt popülasyonlarının tükenmesine neden olabileceğini ortaya koymaktadır. Ancak bu çalışmanın tek bir zaman diliminde elde edilen örnekler üzerinde yapılmış olması, immün hücre yanıtının zaman içinde değişebileceği bilgisi göz önüne alınınca genelleştirilebilir sonuçlar elde edilmesini zorlaştırmaktadır.The incidence of melanoma is rising worldwide, with advanced cutaneous melanoma driving significant mortality rates. While immune checkpoint inhibitor (ICI) therapies such as anti-programmed death receptor 1 (anti-PD-1) and anti-cytotoxic T cell-associated antigen 4 (anti-CTLA-4) have revolutionized cancer treatment, a substantial proportion of patients fail to benefit in the long term due to immune-related adverse events (irAEs), and resistance mechanisms. Anti-Tumor Necrosis Factor (TNF) therapy effectively manages some irAEs, such as colitis, and, paradoxically, can improve the efficacy of ICI at least in some mouse cancer models, suggesting that anti-TNF combination with ICI may improve tumor responses, while reducing toxicities. It remains to clarify the pharmacodynamics impact of TNF inhibitors combined with ICI in mouse cancer models. Recent research utilizing single-cell RNA sequencing to investigate immune cell populations in melanoma has revealed significant diversity in their composition. This diversity within the heterogeneous tumor microenvironment is likely to play a pivotal role in determining therapy outcomes. In this study, analyses of single cell transcriptomics data from CD45+ Tumor-infiltrating leukocytes from B16-OVA melanoma murine models were conducted using computational tools to compare two therapy regimens: a bitherapy, combining anti-PD-1 and anti-CTLA-4, and a tritherapy, combining anti-PD-1, anti-CTLA-4 and anti-TNF. The workflow encompassed preprocessing, cell-type annotation, analyses of cell-type proportions, differentially expressed genes (DEGs), gene set enrichment, and over-representation, and finally, cell-cell interaction analysis. Results showed that the Anti-TNF significantly reduced regulatory T cells, natural killer cells, and non-classical monocyte populations. However, the low number of DEGs between therapies within these populations suggests that anti-TNF primarily affects cell abundance rather than modulating gene expression profiles. Cell–cell interaction analysis revealed CCL3–CCR4/CCR5 interactions between CD8? T cells and Tregs in the bitherapy group, indicating that the higher presence of Tregs may be driven by this chemokine-mediated recruitment. Intriguingly, CD8? T cells in the bitherapy group exhibited a stronger effector profile, and a specific subpopulation of CD8? T cells was identified as the most affected by treatment. Within this subset, TNFR1 signaling and apoptosis-related pathway enrichment were observed in the bitherapy group, whereas CD8? cells in the tritherapy group showed increased proliferative activity. These findings suggest that the presence of TNF may contribute to the depletion of certain CD8? subsets over a longer experimental timeframe. However, the fact that this study was conducted on samples obtained at a single time point makes it difficult to establish a generalizable conclusion, considering that immune cell responses may vary over time.