Mapping the light-dependent interaction sites on Drosophila biological clock photoreceptor

Abstract

Biyolojik saat birçok canlıda fizyolojik olayları ve metabolizmayı günün belirli saatlerinde optimal hale getirerek canlılığın sürdürülmesine katkı sağlar. Fotoreseptör moleküller canlının biyolojik saatini Dünya'nın jeolojik saatine senkronize ederek fonksiyonel kılar. Şu ana kadar yapısal olarak en iyi aydınlatılmış fotoreseptör bir model organizma olan Drosophila melanogaster'e ait Cryptochrome (dCry) fotoreseptörüdür. Işık dCry molekülünün kofaktörü Flavin tarafından algılandığında proteininin C-terminali açılır oluşan bu yapısal değişim sayesinde önce Jetlag ve Timeless ardından Brwd3 molekülleri dCry ile etkileşime başlar. Bu etkileşim sonucunda Jetlag Timeless proteinini ubiqitinleyerek yıkılımına yol açar. Timeless ile kompleks halde bulunan Period molekülü de tek başına stabil olamayacağından derhal yıkılır. Bu ani yıkılım moleküler saatten iki molekülü uzaklaştırdığı için saat resetlenir ve yıkılan Timeless ve Period proteinlerinin yeniden sentezlenmesiyle günlük moleküler saat resetlenir. Brwd3 ise dCry'ı ubiqitinleyerek yıkılıma götürür. Işığı algılayacak asıl fotoreseptör de ortadan kalkınca biyolojik saat günde sadece bir kere resetlenmiş olur. Fakat konu ışık tarafından oluşturulan tepkimelerin takibine geldiğinde günümüzdeki teknik kısıtlamalar sebebiyle birçok aydınlatılamayan nokta vardır. dCry'ın Jetlag ve Timeless ile etkileşim noktaları bilinmemektedir. dCry, Jetlag ve Timeless arasındaki ışığa bağımlı reaksiyonları saflaşıtılmış proteinleri kullanarak çalıştık. Çünkü nokta mutasyonu veya domain delesyonu ile bu bölgeleri tanımlamak mümkün değildir. Mutant dCry flavine bağlanamaz ve bu yüzden dCry'ın ışığı algılayamaz hale gelir. Danışmanımın önceki çalışmalarında dCry'daki yapısal değişimlerin keşfinde kullandığı kısmi tripsinizasyon tekniğini ortamda Tim ve Jet varken uyguladık. Çalışma prensip olarak şu şekildedir: Jetlag ve Timeless ışık altında Cryptochrome molekülüne bağlandığında Tripsine erişimi bloke edecek ve bloke edilen bölgeler immunoblot ve SDS-PAGE, protein boyama tekniği ile tespit edilecektir. Bu sayede aydınlık ve karanlık ortamda uygulanan tripsinizasyon tekniği ile dCry üzerindeki Timeless ve Jetlag bağlanma bölgeleri ortaya çıkartıldı.The sole photoreceptor responsible from circadian clock resetting in Drosophila is Cryptochrome (dCRY) protein. Light stimulated dCRY initiates a signaling cascade which results in the rapid removal of Timeless (TIM) and Period (PER) proteins from the core clock. In the core clock, CLOCK and CYCLE proteins transactivate TIM and PER expressions, which suppress the CLOCK/CYCLE activity afterwards to generate an oscillatory expression pattern on CLOCK/CYCLE complex controlled genes. Light activates dCRY by relaxing its C-terminus, which is bended over the FAD binding region under dark condition. TIM, JET and BRWD3 bind to dCRY to form the photoreceptor complex after light opens C-terminus of dCRY. On this photoreceptor JET and BRWD3 ubiquitylate TIM and dCRY and yield to degradation respectively. Degradation of dCRY ensures that the photoreceptor is removed to prevent a continuous resetting. The degradation of TIM also leads to PER degradation which resets the circadian clock by releasing the inhibition of CLOCK/CYCLE activity. We aimed to discover the binding/interaction sites of JET and TIM on dCRY protein. Point or deletion mutations generally prevents proper folding of dCRY on its light sensitive co-factor FAD, therefore we used partial trypsinization to detect probable interaction sites of dCRY for JET and TIM, under dark and light conditions. JET and TIM block certain trypsin attack sites via attaching its docking site on light induced dCRY. Conserved fragments were detected by immunoblot and SDS-PAGE/protein staining techniques. With the guidance of these data, we have mapped approximate light-dependent binding sites of JET and TIM on dCRY.