The effects of suppression of CRY1 ınteractors by rna ınterference

Abstract

Sirkadiyen saat, organizmaların çevresel ışık-karanlık döngüsüne uyum sağlamasını mümkün kılan endojen bir zamanlayıcıdır ve birçok fizyolojik süreci düzenleyen transkripsiyon-ters transkripsiyon döngüleriyle çalışır. Bu mekanizmanın baskılayıcı kolunun temel bileşenlerinden biri olan CRY1 proteininin etkileşim ağı, saatin hassas çalışmasını etkileyen önemli düzenleyicileri içerebilir. Bu çalışmada, BioID (Biotin Identification) ve Ko-immunopresipitasyon (Co-IP) ile daha önce belirlenen altı CRY1 etkileşimli aday genin (PURG, AURKAIP1, CCT2, TNIP1, GLYR1 ve LPCAT1) sirkadiyen ritim üzerindeki işlevleri araştırılmıştır. Bu amaçla, insan osteosarkom hücre hattı U2OS p(BMAL1)-dLuc, siRNA aracılığıyla susturulmuş ve gen dozuna (1, 2.5 ve 5 pmol) ve hücre yoğunluğuna (5.000 ve 10.000 hücre/kuyu) göre deneysel varyasyonlar oluşturulmuştur. Transfeksiyon sonrası hücreler dexametazon ile senkronize edilerek gerçek zamanlı biolüminesans ölçümleri 5 gün boyunca kaydedilmiş, BMAL1 promoterine bağlı luciferase aktivitesi üzerinden amplitüd, faz ve periyot parametreleri değerlendirilmiştir. Ölçümler Synergy H1 cihazı ile yapılmış; veriler ChronoStar, BioDare2 ve GraphPad Prism ile analiz edilmiştir. Susturma verimliliği ise RT-qPCR yöntemiyle (Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit) doğrulanmıştır ve Knockdown % = (1 - [siRNA fold change / kontrol fold change]) × 100 formülüyle hesaplanmıştır. Gerçek zamanlı biyolüminesans ölçümleri ve istatistiksel analizler sonucunda, CRY1 interaktörlerinin sirkadiyen ritim üzerindeki etkilerinin doz ve parametre bazında farklılık gösterdiği gözlemlenmiştir. 2.5 pmol siRNA ile yapılan knockdown deneylerinde, GLYR1, AURKAIP1, CCT2, LPCAT1 ve PURG genlerinin periyod üzerinde anlamlı etkileri olduğu bulunmuştur. GLYR1 kısa periyotlara neden olurken, diğer genler daha uzun periyotlarla ilişkilendirilmiştir. Bu etkiler, genlerin saat döngüsünün hızını doğrudan etkileyebilecek potansiyel düzenleyici roller taşıdığını göstermektedir. Bununla birlikte, 5 pmol siRNA dozunun sitotoksik etki gösterdiği, 1 pmol dozunun ise bazı genler için yetersiz olduğu belirlenmiştir. En tutarlı sonuçlar 1.25 ve 2.5 pmol dozlarında elde edilmiştir. Faz ve amplitüd analizlerinde ise benzer şekilde çeşitlilik gözlenmiştir. AURKAIP1, CCT2, PURG ve TNIP1 knockdown'ları fazı anlamlı şekilde geciktirmiştir; bu da bu genlerin saat genlerinin pik zamanlamasını etkileyebileceğini düşündürmektedir. Amplitüd parametresinde ise bazı genler, örneğin, LPCAT1 knockdown'u amplitüdü düşürmüştür. Elde edilen sonuçlar, bu interaktörlerin sirkadiyen saat üzerinde farklı mekanizmalarla etkili olabileceğini ve her birinin özgün düzenleyici özellikler taşıdığını ortaya koymaktadır. Bu çeşitlilik, CRY1 etkileşim ağı içindeki genlerin hem çekirdek saat mekanizmasında hem de çevresel saat çıktılarında rol oynayabileceğini düşündürmektedir.The circadian clock governs daily rhythms in physiology and behavior via transcription–translation feedback loops (TTFLs). Within this system, CRY1 functions as a core repressor of the CLOCK:BMAL1 transcriptional complex. To identify novel regulators of CRY1 activity, we selected six interacting candidate proteins PURG, AURKAIP1, CCT2, TNIP1, GLYR1, and LPCAT1 based on BioID proximity labeling and co-immunoprecipitation (Co-IP) results. We used U2OS p(BMAL1)-dLuc reporter cells, which stably express luciferase under the control of the BMAL1 promoter, to monitor circadian oscillations in real time. Knockdowns were performed using FlexiTube siRNAs targeting each gene at three different doses (1, 2.5, and 5 pmol) and two cell densities (5,000 and 10,000 cells/well) with Lipofectamine RNAiMAX as the transfection reagent. Following synchronization, bioluminescence was recorded at hourly intervals over five days using a Synergy H1 multimode plate reader. Circadian parameters period, phase, and amplitude were extracted using ChronoStar and BioDare2 platforms. Knockdown efficiencies were validated via RT-qPCR using the Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit, with GAPDH as the housekeeping gene. Knockdown analyses of CRY1 interactors revealed that GLYR1 robustly shortens the circadian period, highlighting its strong role in accelerating core clock function. AURKAIP1 and CCT2 significantly lengthened the period and delayed phase, suggesting they slow down and shift the molecular clock. TNIP1 specifically caused a phase delay without affecting period or amplitude, implying a role in timing regulation. LPCAT1 knockdown led to moderate period extension and reduced amplitude, pointing to weakened rhythmic strength. Lastly, PURG knockdown mildly extended the period and delayed phase, indicating a subtle modulatory role. These findings demonstrate the functional diversity of CRY1 interactors in shaping circadian rhythm parameters.