Coiled coil domain containing protein 124(CCDC124)' ün hücre içi lokalizasyon ve translokasyon dinamiğinin incelenmesi

Abstract

CCDC124 (Coiled-coil domain containing 124) proteini mantardan insana kadar tüm ökaryotlarda korunmuş RNA-bağlayıcı bir proteindir. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar CCDC124 proteininin hücre döngüsünün interfaz evresinde sentrozomda konumlandığı, post-anafaz evresinden sitokinetik bölünmeye kadar olan sürede ise orta cisimcikte (midbody) konumlandığını göstermektedir. Ayrıca Ccdc124 geninin CRISPR/Cas9 yöntemi ile susturulması durumlarında ise hücre yapısının bozulduğu ve çok çekirdekli yapıların oluştuğu gözlenmiştir. Son gerçekleştirilen çalışmalarda CCDC124 proteininin nükleolus belirteci Nükleofosmin ile etkileşimi gösterilmiştir. Farklı şartlarda hücrenin farklı kompartmanlarında konumlanan ve bu konumlandığı yapıların membransız organeller özelliği göstermesi ve CCDC124 proteininin etkileşim partnerlerini bulmaya yönelik yapılan çalışmalar doğrultusunda stres granül oluşumunda etkili olan protein partnerleriyle etkileşmesi CCDC124 proteininin stres granül oluşumunda etkili olabileceği düşüncesini açığa çıkartmıştır. Bu doğrultuda tez kapsamında yapılan çalışmaların ilk aşamasında, CCDC124 proteinin amino (N) ve karboksil (C) ucuna farklı büyüklükteki bölünmüş GFP11 fragmenti eklenerek CCDC124 proteininin insan osteosarkoma (U2OS) ve embriyonik böbrek (HEK293T) hücre hattında kalıcı ifadesi sağlanmıştır. Bu yaklaşımla CCDC124 proteininin hücre içerisinde rahat bir şekilde gözlenmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan GFP11x4 ve GFP11x1 etiketli CCDC124 proteininin floresan yoğunluğuna bakıldığında CCDC124 proteininin C terminalinde konumlanan GFP11x4 proteini daha yüksek konsantrasyon gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, U2OS hücre hattında kalıcı ifadesi sağlanan hücrelerin viral stres (Poly IC), sıcaklık stresi (46 C°) ve oksidatif stres (H2O2) uygulaması yapılarak CCDC124 proteininin stres granül belirteci olan G3BP1 ile etkileşimi immünboyama yöntemi yapılarak araştırılmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise g3bp1 geni mCherry-N1 plazmidine klonlanarak CCDC124 proteininin, aşırı ifadesi gerçekleştirilmiş G3BP1 proteini ile normal büyüme şartlarında ve stres şartları altında canlı hücre görüntülemesi ve birlikte çöktürme deneyleri gerçekleştirilerek G3BP1 ve CCDC124 proteininin ortak konumlanma gösterip göstermediğine dair veriler elde edilmiştir.Protein is an RNA-binding protein that is conserved in all eukaryotes from fungi to humans. Studies done in this contex indicate that the CCDC124 protein is located in centrosome during interphase phase of the cell cycle, and in the midbody from the post-anaphase phase to the cytokinetic division. It is also observed that the cell structure is disrupted and multinucleated structures were formed when Ccdc124 gene was silenced by CRISPR/Cas9 method. At the last studies protein's colocolization with Nucleophosmin is showed which is the marker of nucleolus. To evidence is shown whether CCDC124 protein is colocolizated with protein partner interacted at stress granule and under the different conditions CCDC124 protein is localizated at the different location where is membranless organells. In the studies are carried out to find interaction partners of the CCDC124 protein, which is located in different compartments of the cell under different conditions, it has been determined that it intteracts with protein partners that are effective in stress granule formation. This result is revealed the idea that the CCDC124 protein may be effective in stress granule formation. In the first part of this thesis, CCDC124 protein in the human osteosarcoma (U2OS) and embryonic kidney cell line is provided stably expression by adding different size GFP11 fragment in amino (N) and carboxyl (C) teminus. With this approach, it is aimed to easily observe the CCDC124 protein inside the cell. When looking at the fluorescence intensity of the constructed CCDC124 labbeled with GFP11x4 ve GFP11x1, it is determined that GFP11x4 protein located in C terminus of the CCDC124 protein showed a higher concentration. In the second part of this thesis, stably cell line is exposed to viral stress (Poly IC), heat stress (46 C°) and oxidative stress (H2O2) and CCDC124-G3BP1, stress granule markers, proteins interaction is investigated by immunofluorescence. The last part of this thesis, g3bp1 gene is cloned into mCherry N1 plasmid and data are obtained on whether overexpression G3BP1 and CCDC124 protein are showed colocolization under normal growth conditions and stress condition by live cell imaging and coimmunoprecipitation experiments.