Drosophila Sirkadiyen Fotoreseptör İnteraktomunun Fonksiyonel Karakterizasyonu

Abstract

Hayvanlarda transkripsiyon-translasyon geri bildirim mekanizması tabanlı moleküler sirkadiyen saatin pozitif ve negatif kolu arasındaki aktivasyon ve baskılama sirkadiyen saatçe düzenlenen genlerdeki osilasyonun esasını oluşturur. Yaklaşık 24 saatlik osilasyonun güneş saatiyle senkronizasyonu fotoreseptör proteinlerince sağlanır. Sirke sineği (Drosophila melanogaster) model organizması sirkadiyen saatin ışık tarafından resetlenmesi ve manyetik alanın algılanması bakımından çalışılmaktadır. Drosophila fotoreseptörü Cryptochrome proteinin FAD kofaktörü ışığı algılayınca oluşan konformasyonel değişimini proteinin C-terminaline yansıtır. Bu sayede Cryptochrome?un Jetlag, Timeless ve Brwd3 gibi proteinlerle etkileşimi başlar. Işık etkisiyle Jetlag, Timeless proteinini ubikitinleyerek yıkılıma gönderir. Timeless 10 dakikada yıkılarak sirkadiyen saati resetlerken ardışık Brwd3 ve/veya Jetlag tarafınca ubiktinlemeyle Cryptochrome da 1 saat içinde yıkılır. Manyetik alan değişiminin algılanması ve ışığa bağımlı reaksiyonların 1-60 dakika içerisinde tamamlanması nedeniyle çok hızlı etkileşimlerin klasik birlikte çöktürme gibi yollarla gösterilmesi güçtür. Ancak, son yıllarda geliştirilen 10-30 dakikada tamamlanan yakınlığa bağımlı işaretleme ve ürünlerin kütle spektrometresiyle tanımlanabilmesi bir fırsat oluşturdu. Projemizde, yakınlığa bağımlı işaretleme yapabilen APEX2 ve TurboID sistemlerinin Cryptochrome proteinine füzyonuyla, S2 hücrelerinde ışık ve karanlık altında gerçekleşen olası etkileşimler kütle spektrometresiyle tanımlandı. İstatiksel olarak anlamlı olanlar seçildikten sonra boyları klonlama için uygun olanlarının klonlanıp anlatımlarıyla kararlılıklarına bakıldı. Daha sonra bu etkileşimlerin klasik birlikte çöktürmeyle sınanması verilerin güvenirliği gösterdi. Öncelikle Jetlag ve Timeless proteinlerin Cryptochrome ışığa bağımlı bağlanmasının klasik birlikte çöktürmeyle gösterilmesinin mümkün olmasıyla yeni belirlenen interaktörler de test edildi. Sonuç olarak bazı ışığa bağımlı ve bağımsız etkileşimlerinin çoğunun klasik birlikte çöktürmeyle de gösterilmesi mümkün olurken bazılarının gösterilememesi her etkileşimin birlikte çöktürme ile onanamadığını göstermesiyle yakınlık bağımlı işaretlemenin, iyileştirmelerle çok daha fazla etkileşimleri keşfedilebileceğine işaret etmiştir. Ayrıca bu proje kapsamında gösterilen ışığa bağımlı etkileşenlerin optogenetik uygulamaları için yeni adaylar ortaya koyarken manyetik alan algılanmasının çalışılması konusunda bir model de oluşturmuştur. Proje kapsamında bir yüksek lisans tezi tamamlanmış bir doktora tezi son aşamaya gelmiştir. Bir görüş makalesi yayınlanıp bir araştırma makalesi yayın için gönderilmiştir.