Alev ağacı ve ın vitro kültürlerinden izole edilen PGB_invit bakterisi arasındaki moleküler etkileşimin belirlenmesi

Abstract

In vitro koşullarda büyütülmüş alev ağacı (Photinia × fraseri Dress.) mikrogövdelerinden izole edilen ve Pseudorhodoplanes sp'nin bir üyesi olan endofitik, yararlı PGB_invit bakterisi, nitrojeni fikse edebilme, indol asetik asit ve giberellik asit gibi bitki büyümesini teşvik edici düzenleyiciler üretebilme yeteneklerine sahiptir. Bu faydalı özelliklerinden dolayı, PGB_invit, alev ağacı mikrogövdelerinin periyodik altkültür gerekmeden 25±2ºC'de 16 aya kadar korunmasını sağlamaktadır. Bu doğrultuda tezin amacı, PGB_invit'in alev ağacı üzerindeki fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler etkilerinin incelenmesidir. Yapılan çalışmalar sonucunda, PGB_invit'in optimum inokulum konsantrasyonunun 106 kob ml-1 ve optimum inkübasyon süresinin 60 gün olduğu tespit edilmiş, GFP ile etiketlenmesi yoluyla endofitik bir bakteri olduğu konfokal mikroskopi ile gösterilmiştir. Bununla birlikte, PGB_invit ile inokülasyona yanıt olarak, alev ağacında prolin konsantrasyonunun önemli ölçüde arttığı, hücresel H2O2 içeriğinin azaldığı, katalaz aktivitesinde ise artış olduğu tespit edilmiştir. RNA sekanslaması sonucunda, aktif ve inaktif PGB_invit ile inoküle edilen ve kontrol grubu alev ağacı örnekleri arasında ifade seviyeleri değişen genler belirlenmiştir. Bu genlerden, "MID1-Tamamlayıcı Aktivite 1", "Ubiquitin-konjuge edici enzim E2", "E3 ubiquitin-protein ligaz RHA1B benzeri", "4-kumarat--CoA ligaz benzeri 9" ve "Metiyonin aminopeptidaz 2B benzeri" olmak üzere beş genin, deney grupları arasındaki gen ifade seviyelerindeki değişiklikler qRT-PCR ile doğrulandı. Bu genler arasından bitki bağışıklığı ve stresinde önemli rol oynayan "ubikuitin-konjuge enzim E2", "E3 ubikuitin-protein ligaz RHA1B benzeri"'nin ifade seviyeleri PGB_invit ile inoküle edilen örneklerde kontrole göre azalmıştır. Bu da PGB_invit'in, alev ağacının bağışıklık sistemini uyarmadığını ve stresi azaltmada olumlu bir etkiye sahip olduğu savını desteklemektedir. Tüm bu sonuçlar doğrultusunda, PGB_invit'in, alev ağacının bitki gelişimine katkı sağlayan endofitik bir bakteri olduğu gösterilmiştir. Bu tez TÜBİTAK tarafından 117R002 numaralı proje ile desteklenmiştir.The endophytic, beneficial PGB_invit bacterium, a member of Pseudorhodoplanes sp, isolated from Fraser's Photinia (Photinia × fraseri Dress.) microshoots that grown in vitro, has the ability to fix nitrogen and produce plant growth promoting regulators such as indole acetic acid and gibberellic acid. PGB_invit provides microshoots to be conserved for up to 16 months at 25±2ºC without a need of periodic subculture. The aim of this thesis is to examine the physiological, biochemical and molecular effects of PGB_invit on Fraser's Photinia. It was determined that the optimum inoculum concentration of PGB_invit is 106 cfu ml-1 and the optimum incubation period is 60 days, and it has been shown by confocal microscopy that it is an endophytic bacterium by labeling with GFP. It was determined that the proline content and the catalase activity increased significantly, while the cellular H2O2 content decreased, in PGB_invit inoculated microshoots. Expression level changes of the "MID1-Complementing Activity 1", "Ubiquitin-conjugating enzyme E2", predicted "E3 ubiquitin-protein ligase RHA1B-like", "4-coumarate--CoA ligase-like 9" and "Methionine aminopeptidase 2B-like" genes were determined and confirmed by qRT-PCR among active and inactive PGB_invit inoculated and the control groups. The expression levels of "ubiquitin-conjugating enzyme E2" and "E3 ubiquitin-protein ligase RHA1B-like", which play an important role in plant immunity, were down-regulated in PGB_invit inoculated microshoots. In conclusion, PGB_invit is a plant growth promoting endophytic bacterium which does not evoke the immune system of Fraser's Photinia and has a positive effect on its proliferation. This thesis supported by TUBITAK project number 117R002.