Characterization and redesign of a new laccase for industrial biotechnological applications

Abstract

Lakkazlar çok çeşitli aromatik ve aromatik olmayan bileşikleri oksitleyen çok bakırlı enzimlerdir. Birçok endüstriyel biyoteknolojik alanda kullanılmalarında geniş substrat seçiciliği etkilidir. Bu nedenle Madurella mycetomatis'in lakkaz geni seçilmiş, pPICZ?A ve pPICZA plazmitleri aracılığıyla heterolog ekspresyon sistemi Pichia pastoris X–33 konak hücresine aktarılmıştır. Transformasyondan sonra, genomik entegrasyon koloni PCR ile doğrulanmış ve lakkaz enzim aktivitesi ABTS içeren MM plate ortamında değerlendirilmiştir. P. pastoris için optimal büyüme koşulları, 18 °C, % 1 metanol, 0.2 mM CuSO4 olarak belirlenmiştir. Rekombinant lakkaz (MmLac) saflaştırılmış ve optimal biyokimyasal koşullar altında 54.4 mgL-1 olarak üretilmiştir. MmLac'ın, asidik pH aralığında (4.0–6.0) iyi aktivite gösterdiği; katyonik metaller, organik çözücüler varlığında ve yüksek sıcaklıklarda (50 °C–60 °C) stabil olduğu; –20 °C ve –80 °C'de sekiz haftaya kadar uzun süreli saklama için stabil olduğu gösterilmiştir. Ayrıca kinetik özellikleri ABTS, 2,6–DMP, SGZ substratları için hesaplanmıştır. MmLac enziminin moleküler ağırlığı 67.4 kDa iken, deglikolize formu 62.0 kDa olarak hesaplanmıştır. Biyoinformatik AutoDock programı kullanılarak lakkaz enziminin aktif bölgesine 2,6–DMP substratı bağlanarak analiz edilmiştir. Rekombinant lakkazın ayrıntılı yapısal özellikleri belirlenmiş, dekolorizasyon ve tekstil ağartma uygulamalarındaki kullanımı incelenmiştir. MmLac yüksek verimlilik ve stabilite sergilemesinin yanında daha az kimyasal madde girişi gerektiren tekstil beyazlığında bir artışa neden olmuştur. Enzimin bu performansı, onu tekstil biyoteknolojisi uygulamalarında ayrıca çevre ve gıda teknolojilerinde de kullanımı için araştırmaya değer kılmaktadır.Laccases are enzymes that oxidize a wide variety of aromatic and non-aromatic compounds. Their wide substrate selectivity is effective in their use in many industrial biotechnological fields, hence, the laccase gene from Madurella mycetomatis was selected and transferred to the heterologous expression system Pichia pastoris X–33 host cell using pPICZ?A and pPICZA plasmids. Following transformation, the genomic integration was confirmed by colony PCR and laccase enzyme activity assessment using MM plates containing ABTS medium. The optimal growth conditions for P. pastoris are 1% methanol, 0.2 mM CuSO4 at 18 °C. Recombinant laccase (MmLac) was produced and purified under these optimal conditions as 54.4 mgL-1. MmLac demonstrates good activity in low pH (4.0–6.0); it's stable in the presence of cationic metals, organic solvents and under high temperatures (50–60 °C); also stable for long-term storage at –20 °C and –80 °C for up to eight weeks. Kinetic properties of MmLac were calculated for ABTS, 2,6–DMP and SGZ substrates. While the molecular weight of the MmLac enzyme was 67.4 kDa, the deglycosylation form was 62.0 kDa. Additionally, it was analyzed by docking 2,6–DMP substrate to the active site of laccase enzyme with the bioinformatics AutoDock program. Detailed structural properties of the recombinant laccase were determined, and its utility in decolorization and textile bleaching applications was examined. MmLac, besides showing high efficiency and stability, it increased textile whiteness reducing chemical input. The enzyme's performance makes it worthy of investigation within textile applications, environmental and food technologies.