Sitokinezde Temel Rol Oynayan Ccdc124 Proteininin Moleküler Etki Mekanizmalarının Belirlenmesi

Abstract

Sitokinetik ayrışma (cytokinetic abscission), mitoz sürecinde ortaya çıkan kardeş hücrelerin arasındaki bölgenin gitgide daralarak kopmasını, ve iki hücrenin fiziksel olarak birbirlerinden ayrılmasını tanımlayan süreçtir. Ökaryot organizmalarda yüksek oranda korunmuş bir gen olan CCDC124 (Coiled-coil domain-containing-124)?ün ifadesi ile tüm insan dokularında üretilen, ve sitokinetik ayrışmada temel bir görevi olan Ccdc124 proteininin, yeni bir sentrozom ve orta-cisimcik proteini olduğunu daha önceki çalışmalarımızda bulgulamıştık. Bu proje kapsamında yapılan çalışmalarda, öncelikle yeni bir metod olan BioID yöntemi ve kütle- spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemi kullanılarak Ccdc124 proteini ile etkileşen hücresel faktörler bulgulanmıştır. Ayrıca, biyoenformatik analizler ve validasyonları ile de, orta- cisimcikte Ccdc124 ile etkileşen faktörler incelenmiş, ve orta-cisimciğe konumlanan bazı faktörler ile Ccdc124 arasındaki etkileşim bulgulanmıştır. Bunlara parallel çalışmalarda, CCDC124 geni CRISPR/Cas9n (Cas9-nickase) yöntemi ile hem p53-pozitif özellikteki HEK- 293 (İnsan embryo böbrek), hem de p53-negatif ve p53-pozitif kolonileri ayrı ayrı olmak üzere HCT-116 (kolon kanseri) hücrelerinde genom düzeyinde modifikasyonlara uğratılmış, ve değişik mutasyonların protein miktarına ve sitokinetik ayrışmaya etkileri incelenmiştir. Bunlara ek olarak, Ccdc124 proteinini post-translasyonel değişikliklere uğratması olası CK-2 (Casein Kinase-2) ve Plk-1 (Polo-like kinase-1) kinazlarının Ccdc124 ile etkileşimleri çeşitli görüntüleme yöntemleri ve kinaz inhibitörleri kullanılarak bulgulanmıştır. Çalışmalardan alınan sonuçlara göre, Ccdc124 proteini RNA metabolizmasında görev alan ve özellikle hücre sitoplazması ve çekirdekte faz-ayrışması (phase-separation) yolu ile Stress-granülleri benzeri membransız organellerin (droplet organelles) ve biyomoleküler komplekslerin oluşmasında etkili olduğu bilinen hnRNP?ler, Ybx-1, Ddx ailesi üyeleri, Staufen1/2, Tardp2 ve benzeri moleküllerle etkileşmektedir. Bunun yanı sıra, CRISPR/Cas9n ile CCDC124 geni mutasyona uğratılmış kolonilerde, sitokinetik ayrışmanın inhibisyonu time-lapse mikroskopi görüntüleme yöntemleri ile tesbit edilmiştir. Ccdc124 proteininde bulunan ve GFP veya RFP ile işaretlenmiş Ccdc124 proteininde (Ccdc124-GFP/RFP) yukarıda anılan kinazların (CK-2 ve Plk-1) etki bölgelerine denk gelen serin rezidülerinin alanine çevrildiği durumlarda (S122A ve S141A), hücre içerisinde Stres-granülleri benzeri yapıların akümüle olduğu belirlenmiştir. Bu sonuç, hücre biyolojisinin yeni anlaşılan konularından olan, sitoplazmanın membransız kompartmanlarla organizasyonunda Ccdc124?ün regülatör bir rol oynayabileceğini göstermektedir.