The effect of small molecule modulators of cryptochrome on apoptosis

Abstract

Sirkadiyen ritimler çok çeşitli günlük fizyolojik ve metabolik süreçleri düzenlerler ve bir transkripsiyon-translasyon geri besleme döngüsü (TTFL) prensibine göre işleyen moleküler saatler tarafından üretilirler. TTFL'de, pozitif koldaki CLOCK ve BMAL1 transkripsiyon faktörleri, negatif koldaki Kriptokrom (Cry) ve Periyot genlerini ve sirkadiyen saat tarafından düzenlenen genleri aktive eder. Negatif kol genlerinin ürünleri ise CLOCK-BMAL1 aktivitesini inhibe eder. Bu aktivasyon ve inhibisyon, transkriptom ve proteomdaki günlük salınımları üretir. Sirkadiyen saatteki anormallikler birçok hastalıkla ilişkilidir. Bu nedenle, moleküler saat bileşenleri, terapötik amaçlar için çekici hedeflerdir. Böyle bir modelde, p53 mutant hücrelerinde Cry genlerinin ortadan kaldırılmasının, hücreleri UV-benzeri ajanlarla oluşturulan DNA hasarına karşı hassas hale getirdiği ve p53 anlatımı yapmayan farelerde tümörsüz yaşam süresini 1.5 kat uzattığı gösterilmiştir. Bu tezde, küçük moleküller aracılığıyla CRY işlevinin bozulmasının, CRY anlatımın genetik olarak ortadan kaldırılmasıyla oluşan fenotipi üretip üretmediğini test ettik. Küçük moleküller, bir ubikitin ligaz olan FBXL3 proteininin bağlandığı CRY'ın yüzeyine sabitlenecek şekilde tasarlanmıştır. FBXL3 proteini, CRY proteinlerini ubikitinle işaretleyerek yıkılıma götürmektedir. Moleküllerin bazılarının FBXL3'ün bağlanmasını arttırması ve CRY proteinlerini kararsız hale getirerek CRY'ın genetik yolla ortadan kaldırılmasıyla elde edilen fenotipe yol açması bekleniyordu. Toksik olmayan adaylar CRY'ı kararsızlaştırmaları ve sirkadiyen saat üzerindeki etkileri bakımından incelendi. Son olarak, seçilen moleküller, Ras onkogeni ile transforme edilmiş p53-anlatımı yapmayan fare fibroblastlarında apoptozun arttırılması bakımından test edildi. Moleküllerden N16 olarak adlandırılan en az bir molekül, model hücre hattımızda oksaliplatin kaynaklı apoptozu orta derecede artırmıştır ve gelecek çalışmalar için bir model oluşturmuştur.Circadian rhythms regulate a wide variety of daily physiological and metabolic processes and are generated by molecular clocks based on a transcription-translation feedback loop (TTFL). In the TTFL, CLOCK and BMAL1 transcription factors of the positive arm transactivate Cryptochrome (Cry) and Period genes of the negative arm as well as circadian clock-regulated genes. The products of the negative arm genes inhibit CLOCK-BMAL1 activity. This activation and inhibition generates daily oscillations in transcriptome and proteome. Abnormalities in the circadian clock are associated with many diseases. Therefore, the molecular clock components are attractive targets for therapeutic purposes. In such a model, it was shown that the knockout of Cry genes in p53-mutant background sensitizes cells to UV mimetic-induced DNA damage and extends the tumor-free lifetime by 1.5-fold in p53-null mice. In this thesis, we tested whether chemical interference with CRY function would produce the same phenotype as in CRY knockout cells. The small molecules were designed to dock on the surface of CRY, where its ubiquitin ligase, FBXL3 binds. FBXL3 ubiquitinates CRY proteins for degradation. Some of the molecules were expected to enhance the binding of FBXL3 and induce the destabilization of CRY proteins to mimic knockout phenotype. Nontoxic candidates were tested for CRY destabilization and their effects on the circadian clock. Finally, selected molecules were tested for the enhancement of apoptosis in Ras-transformed p53-null mouse fibroblasts. At least one molecule, called N16, moderately increased oxaliplatin-induced apoptosis in our model cell line and offers a model for further development.