Metal iyonlarının ve surfaktanların Geobacillus kaustophilus lipaz aktivitesine ve yapısal kararlılığına etkisinin incelenmesi

Abstract

Bu tez çalışmasında, Geobacillus kaustophilus lipaz geni pET22b vektörüne klonlanarak Escherichia coli'de eksprese edildi ve DEAE-selüloz rezini kullanılarak saflaştırıldı. Proteaz inhibitörü olan PMSF kullanılmadan yapılan saflaştırmada moleküler ağırlığı ~41 kDa (teorik ~43 kDa) olan, yüksek lipaz aktivitesi (~5000 unit/mg protein) gösteren bir protein elde edildi. MALDI-TOF/MS ile yapılan analizlerde C-ucunda bulunan ?LAEQLASLQP? peptitin (MW: 1069 kDa) eksik olduğu tespit edildi.Farklı metal tuzlarının (CaCl2, MgCl2, CoCl2, NiCl2, MnCl2 ve ZnCl2) enzim aktivitesine etkisi, substrat olarak p-nitrofenil palmitat kullanılarak spektroskopik yöntemle incelendi. Ca2+, Mg2+, Mn2+ ve Co2+ aktiviteyi artırırken, Zn2+ ve Ni2+ inhibe etti. 1 mM Tween deterjanları lipaz aktivitesini tamamen inhibe ederken, Triton X-100 aktivite üzerine değişken etki gösterdi. Ayrıca Ca2+ ve Zn2+'nin lipazın yapısına etkisi Sirküler Dikroizm spektroskopisi ile incelendi. Sadece EDTA ile yapılan ölçümlerde lipazın yapısı 70 oC'de tamamen bozulmakta iken, Ca2+ varlığında 80 oC'de bozulmaktadır. Zn2+ iyonu varlığında ise 50 ? C'de enzim tamamen denatüre olmaktadır. Bu sonuçları desteklemek amacıyla da, Floresans Spektroskopisi yöntemiyle Ca2+ ve Zn2+ iyonlarının enzimin yapısına etkisi triptofan ve ANS emisyonu ile incelendi. Ca2+ varlığında triptofan ve ANS emisyonunda bir değişiklik olmazken, Zn2+ varlığında triptofan emisyonu azalmakta, ANS emisyonu da artmaktadır. Aynı deneyler daha önce bu laboratuarda pET28a(+) vektörüne klonlanan ve His-tag'lı olarak saflaştırılan lipaz (His6-lipaz) için de yapılmıştır ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. Genel olarak elde edilen sonuçlar Ca2+ iyonunun lipazın stablitesini artırdığı, Zn2+ iyonunun ise yapıyı bozarak stabilitesini azalttığını göstermektedir.In this thesis, Geobacillus kaustophilus lipase gene was cloned into pET22b expression vector, expressed in Escherichia coli and purified using DEAE-cellulose. During purification PMSF, a protease inhibitör, was not included, so a protein with a molecular mass of ~41 kDa (theoretically 43 kDa) with high lipase activity was obtained. MALDI-TOF/MS analyses revealed that the C-terminal peptide ?LAEQLASLQP? (MW: 1069 kDa) was missing.The effect of various metal ions (CaCl2, MgCl2, CoCl2, NiCl2, MnCl2 ve ZnCl2 ) on the activity of enzyme was investigated by spectroscopic method using p-nitrophenyl as a substrate. Ca2+, Mg2+, Mn2+ and Co2+ increased the activity whereas Zn2+ and Ni2+ were inhibitory. While 1 mM Tween detergents completely inhibited the activity, Triton X-100 showed inhibitory and activatory effects at different concentrations. Moreover, the effects of Ca2+ and Zn2+ on the structure of lipase were examined by circular dichroism spectroscopy. In the presence of EDTA alone, the lipase was completely unfolded at 70 oC, while in the presence of added Ca2+ it was at 80 oC. On the other hand, the enzyme was completely denaturated in the presence of Zn2+ at 50 oC. The effects of Ca2+ and Zn2+ ions on the structure of the enzyme were further investigated by Tryptophan and ANS emission spectroscopy. No significant changes in the tryptophan and ANS emissions were observed in the presence of Ca2+ whereas decreases in the tryptophan emission and increases in the ANS emission were observed with increasing concentrations of Zn2+. Similar experiments were carried out with His-lipase, which was previously cloned into pET28a(+) vector in our lab, and similar results were obtained. Overall the results show that Ca2+ increases the stability of the lipase, whereas the Zn2+ causes significant changes in the structure of the enzyme that result in aggregation.