ATP-bağımlı proteaz HslVU genlerinin Geobacillus kaustophilus'tan klonlanması, DNA dizisinin belirlenmesi ve ekspresyonu

Abstract

Hem ökaryotik hem de prokaryotik hücrede, bir çok hücre içi protein yıkımı ATP bağımlı proteazlar ile başlatılmaktadır. En büyük ATP-bağımlı proteaz olarak bilinen ökaryotik proteazomlar `ubiquitin ile konjuge olmuş' ya da olmamış proteinlerin yıkımını katalize eden multikatalitik proteaz kompleksleridir. Ökaryotik organizmaların yanı sıra Archea'larda da bulunan proteazomlar, hücre içinde stres yanıtı, hücre farklılaşması ve metabolik adaptasyon gibi önemli fizyolojik rollere sahiptir ve bu nedenle medikal uygulamalar için önemli bir potansiyele sahiptirler.Son yıllarda tanımlanan ve izole edilen `heat-shock locus VU' (HslVU) bir ATP-bağımlı proteolitik sistem olup, ökaryotik ve arkeal proteazomun prokaryotik homoloğudur. İki bileşenli ATP-bağımlı proteaz olan HslVU, proteazom-bağlantılı peptidaz aktivitesi gösteren HslV (ß-altbirimi) ve ATPaz ve şaperon aktivitesi gösteren HslU'dan oluşmuştur. Genomik ve kristal yapı çalışmaları sonunda HslVU proteazlar hakkında oldukça geniş bilgi sağlamakla birlikte, sahip oldukları katalitik aktivite ve fonksiyonları hakkındaki bilgiler sınırlıdır.Bu tez çalışmasında, termofilik bir bakteri olan Geobacillus kaustophilus'un HslVU proteazı ilk defa Escherichia coli `de klonlanmış ve eksprese edilmiştir. hslV ve hslU altbirim genleri önce bir klonlama vektörü olan pGEM-T vektöre klonlama ve daha sonra pGEX 6P-1 vektörüne alt-klonlama yapılarak E. coli'ye aktarılmıştır. Yaklaşık 19 kDa büyüklüğündeki HslV ve 50 kDa büyüklüğündeki HslU altbirimleri glutatiyon S-transferaz (GST 26 kDa) proteinleri ile füzyon halinde E.coli BL21 (DE3)'de eksprese edilmişlerdir. Yüksek düzeyde eksprese olan rekombinant proteinlerin enzimatik aktivitelerinin değerlendirilmesi için yapılan çalışmalar, kültür hücre özütleri kullanılarak yapılmıştır. Buna göre, HslVU proteazın kazein hidrolizi için optimum sıcaklık aralığı 55-70 oC ve optimum pH aralığı 5.0-7.0 olarak saptanmıştır.Degradations of many cellular proteins are initiated by ATP-dependent proteases in both eukaryotic and prokarytic cells. Eukaryotic proteasomes, major ATP-dependent proteases, are the multicatalytic complexes which catalyse degradation of ubiquitin conjugated or non-conjugated proteins. Proteasomes, exist in eukaryotic organisms and Archeabacteria have important roles in cellular metabolism such as stress respons, cell differentiation and metabolic adaptation. Therefore, proteasomes have important potantial for medical applications.Recently isolated and identified heat-shock locus VU (HslVU) is an ATP-dependent proteolytic system which is the prokaryotic homolog of eukaryotic and archeal proteasomes. HslVU consists of two different subunits HslV which has proteasom related peptidase activity (ß-subunits) and HslU having ATPase and chaperone activities. Genomic and crystal structure studies provided a lot of information, however the knowledge about catalytic activity and functions of HslVU proteases is still limited.In this study, Geobacillus kaustophilus ATP dependent HslVU protease first time cloned and expressed in E. coli. hslV and hslU subunits genes cloned into pGEM-T cloning vector then subcloned into pGEX 6P-1 in E. coli. HslV (19 kDa) and HslU (50 kDa) were expressed with glutathione S-transferaz (GST 26 kDa) as a fusion protein. Preliminary characterization studies were achieved by using cell free extracts containing overexpressed recombinant proteins. Optimal temperature for HslVU protease activity was observed at 55-70 oC range by using cazein as a protein substrate and optimal pH determined at 5.0-7.0 range.