Transgenik tütünde CRISPR/CAS9 sistemi kullanılarak sistein proteaz gen (NtCP6) ekspresyonunun susturulmasına yönelik çalışmalar

Abstract

Son yıllarda bitkiler, artan oranda rekombinant proteinlerin üretimi için alternatif konakçılar olarak kullanılmaktadırlar. Tütün yabancı proteinlerin ekspresyonu için önemli konakçılardan biridir. Bununla birlikte, üretimde karşılaşılan ana sorunlardan biri, ürün ekstraksiyonu ve saflaştırılmasından önce hasat edilen biyokütlenin depolanması sırasında yabancı proteinin stabilitesidir. Aspartik ve sistein (papain benzeri sistein) proteazları gibi endojen proteazlar, genellikle depolama sırasında protein kaybından sorumlu olarak kabul edilir. Proteaz aktivitesinin, rekombinant protein üretimini iyileştirmek ve ekonomik olarak üretilmesine izin vermek için susturulabileceği düşünülmektedir. Böylece bu çalışmada, yabancı protein birikimini engellediği düşünülen NTCP6 geninin (GeneID: 107781604) CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak transgenik tütünde bakteriyel nitroredüktaz geni olan Ssap-NtrB'nin susturulmasını amaçladık. Tütün bitkisinde NtCP6 geninin ilk ekzonunda iki bölgeyi hedef alan sgRNA kasetleri oluşturulmuşur. Oluşturulan bu kasetlerle enzim kesim/ligasyon reaksiyonu ile tam bir ekspresyon kaseti elde edilmiş ve Golden gate klonlama ile pYLCRISPR/Cas9 plazmitine aktarılmıştır. pYLCRISPR/Cas9 plazmiti aktarılan Agrobacterium transgenik tütün bitkilerine infiltrasyon yöntemiyle transforme edilmiştir. Gözlenen morfolojik farklılıklar, sürgün uzamasının 7 kat azaldığını ve kök oluşumunun, kontrole kıyasla rejenere mutant tütün bitkilerinde geciktiğini gösterdi. Bu sonuçlara göre; bitki papain benzeri sistein proteazlarının bitkilerde yabancı protein stabilitesinde önemli bir rol oynamasının yanısıra bitki büyüme ve gelişiminde de etkili olduğu gözlenmektedir.

In recent years, plants have been used as alternative hosts for the production of increasingly recombinant proteins. Tobacco is one of the attractive host system for expression of the foreign proteins. However, one of the main problems faced in production is the stability of the foreign protein during storage of the harvested biomass prior to the product extraction and purification is the main problem. Endogenous proteases such as aspartic and cysteine (papain-like cysteine) proteases are generally considered as responsible for protein loss during storage. It is contemplated that protease activity may be silenced to improve recombinant protein production and allow it to be produced economically. Thus, in this study, we aimed to silence the NTCP6 gene (GeneID: 107781604) which is thought to inhibit the accumulation of foreign protein, in this case bacterial nitroreductase gene, Ssap-NtrB, in transgenic tobacco by using CRISPR/Cas9 system. In the tobacco plant, sgRNA cassettes are created that target two regions in the first exon of the NtCP6 gene. With these cassettes, a complete expression cassette was obtained by enzyme cut / ligation reaction and transferred to pYLCRISPR / Cas9 plasmid by Golden gate cloning. The pYLCRISPR / Cas9 plasmid transferred to Agrobacterium were transferred to transgenic tobacco plant by infiltration method. The observed morphological differences showed that shoot elongation was reduced 7 fold and root formation was delayed in regenerated mutant tobacco plants in comparison to controls. Based on the these results, although plant papain-like cysteine proteases seems to play an important role in foreign protein stability in plants, it also effects the plant growth and development.