Serbest ve immobilize termofilik Geobacillus kaustophilus L-asparajinaz tip II enzimlerinin karakterizasyonu ve gıda endüstrisinde akrilamid giderimindeki potansiyelinin belirlenmesi

Abstract

L-asparajinaz enzimi (E.C 3.5.1.1), asparajin amino asidini hidroliz ederek aspartik asit ve amonyak oluşumunu sağlayan önemli bir endüstriyel enzimdir. Günümüzde bu enzim, akut lenfoblastik lösemi (ALL) gibi çeşitli kanser türlerinin tedavisinde terapötik ajan olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte son yıllarda özellikle gıda endüstrisinde akrilamid giderici ajan olarak dikkatleri üzerine çekmiştir. Akrilamid, gıdaların yüksek sıcalıklarda kızartılması sonucu asparajin öncül maddesinden oluşmaktadır. L-asparajinaz enziminin asparajini hidroliz ederek oluşan akrilamid miktarını azaltması bir gıda enzimi olarak potansiyelini ve önemini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte gıda endüstrisinde kullanılacak asparajinazların yüksek sıcaklık ve geniş pH aralıklarında kararlı olmaları ve yeniden kullanılabilir olmaları arzu edilen özellikleridir. İstenilen bu özellikler enzimin uygun bir matrise immobilizasyonu ile sağlanabilmektedir. Bu nedenle yapılan tez çalışmasında, termofilik Geobacillus kaustophilus'tan elde edilen serbest L-asparajinaz'ın çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT) üzerine immobilize edilmesi ve hem serbest hem de immobilize enzimin akrilamid giderim potansiyelinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda GkASNaz enzimi, E. coli RosettaTM 2 (DE3) hücrelerinde yüksek miktarda eksprese edilerek Ni-NTA afinite kromatografisiyle 6.14 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan GkASNaz enzimi, MWCNT üzerine kovalent olarak immobilize edildikten sonra her iki enzim karşılaştırmalı olarak karakterize edilmiştir. Karakterizasyon sonuçları serbest ve immobilize enzim için optimum pH'ın 8.5 olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte optimum sıcaklık değeri serbest enzim için 55 oC iken immobilize enzim için 65 oC olarak bulunmuştur. Termal inaktivasyon deneyi, immobilize enzimin termal stabilitesinin serbest GkASNaz'a kıyasla 65 oC'ta 42.6 kat arttığını göstermiştir. Tekrar eden 20 kullanım sonunda ise immobilize enzim başlangıç aktivitesinin %93'ünü korumuştur. Ayrıca serbest ve immobilize enzimin akrilamid oluşumunu 60 dakikada %100 oranında azalttığı tespit edilmiştir.L-asparaginase enzyme (E.C 3.5.1.1) is an important industrial enzyme that hydrolyzes the asparagine to form aspartic acid and ammonia. Today, this enzyme is used as a therapeutic agent in the treatment of various types of cancer, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, in recent years, it has attracted attention as an acrylamide mitigation agent, especially in the food industry. Acrylamide is formed from the precursor of asparagine as a result of frying foods at high temperatures. The fact that the L-asparaginase enzyme reduces the amount of acrylamide formed by hydrolysis of asparagine reveals its potential and importance as a food enzyme. However, there is a need for asparaginases that are stable and reusable at high temperatures and wide pH ranges in the food industry. These desired properties can be achieved by immobilization of the enzyme to a suitable matrix. Therefore, in the thesis study, it was aimed to immobilize free L-asparaginase obtained from thermophilic Geobacillus kaustophilus on multi-walled carbon nanotube (MWCNT) and to examine the acrylamide mitigation potential of both free and immobilized enzyme. For this purpose, GkASNase enzyme was highly expressed in E. coli RosettaTM 2 (DE3) cells and purified 6.14-fold by Ni-NTA affinity chromatography. After the purified GkASNase enzyme was covalently immobilized on MWCNT, both enzymes were characterized comparatively. Characterization results showed that the optimum pH for free and immobilized enzyme was 8.5. However, the optimum temperature value was found to be 55 oC for free enzyme and 65 oC for immobilized enzyme. The thermal inactivation experiment showed that the thermal stability of the immobilized enzyme increased by 42.6 folds at 65 °C compared to free GkASNase. After 20 repeated uses, the immobilized enzyme preserved 93% of its initial activity. In addition, it was determined that free and immobilized enzyme reduces acrylamide formation by 100% in 60 minutes.