Format Dehidrogenaz Enzimlere Ait Aktif Bölgenin Çok Boyutlu Mutasyonel Analizi ile Karbondioksitten (CO2) Yenilenebilir Enerjinin Üretimi

Abstract

Salınımı katlanarak artan sera gazı CO2'in, fotosentetik bakteriler tarafından doğrudan biyoyakıta dönüşümü son yıllarda biyoyakıt eldesi için cazip bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu prosessin ana reaksiyonu CO2'in, biyoyakıt olarak kullanılabilir hidrokarbonlara dönüşümüdür. Bu hidrokarbonlardan formik asit, hidrojen depolamada-taşımada, pratik olarak sahip uygun enerji yoğunluğu ve CO2'den elde edilme potansiyeli, dönüşümünde güvenli ve tutuşmayan bir kimyasal hammadde olarak ilgi çekmektedir. Bu nedenlerden dolayı CO2'i formata çevirecek çok sayıda yöntem ortaya çıkmıştır. Bu yöntemlerden en cazip olanı enzimlerin kullanıldığı düşük maliyetli-yüksek verimli prosesslerdir. Bu süreçlerde kullanılacak enzimleri tanımlamak ya da yeniden tasarlamak birçok alanda kullanım potansiyeli nedeniyle de dikkat çekici olacaktır. Format dehidrogenazların (FDHs) büyük bir kısmı, formatı CO2'e yükseltmektedir. Tersinir yönde ise CO2'i formata indirgemektedir ancak bu yönde düşük aktivite veya düşük kararlılık, FDHs'ın temel problemi olmuştur. Ancak, FDHs'ın formatı CO2'e çevirmesi sırasında ürettiği NADH'ın farklı reaksiyonlarda kofaktör yenilenmesinde kullanılmak üzere verimliliğini, kararlılığını, aktivitesini ve kofaktör bağımlılığını iyileştirmek amacıyla protein mühendisliği ve yapısal çalışmaları hakkında çok sayıda bildirime rağmen protein mühendisliği stratejisi ile FDHs'ın CO2 indirgenme verimliliğini iyileştirme konusunda bir çalışma bulunmamaktadır. Gerçekleştirilen projede, FDHs'ın katalizlediği tersinir yöndeki reaksiyonu için yeni yapısal ve işlevsel ilkelerin bulunmasıyla CO2'in yenilenebilir enerji formlarına dönüştürecek daha verimli NAD+ bağımlı yeni FDH tanımlanması amaçlanmıştır. Projede, daha yüksek verimle CO2'in formata indirgenmesini katalizleyen yeni bir FDH'ın tasarlanması için (10) adet FDH enzimi seçilmiştir. Bu enzimleri kodlayan genlerin ticari olarak klonlanmış halleri elde edildikten sonra; laboratuvarımızda protein ifadeleri gerçeleştirilmiş ve rekombinant DNA teknolojisi ile yüksek saflıklarda elde edilmişlerdir. Saflaştırılan enzimlerin CO2 indirgenme potansiyelleri incelendikten sonra; biyokimyasal yönden karakterize edilmişlerdir. Tüm FDHs'a ait aktif bölgede ve aktif bölgeye yakın amino asit pozisyonlarında CO2 ile olası etkileşimlerde fonksiyonel olabilecek pozisyonları belirlemek için çok boyutlu yapısal analizler gerçekleştirilmiştir. Yabanıl tip bu enzimler arasında CO2'e karşı en yüksek aktiviteyi Chaetomium thermophilum FDH (CtFDH) göstermiştir. Bu nedenle CtFDH enziminin CO2?e karşı aktivitesinde protein mühendisliği ile iyileştirmeler yapmak amacıyla aday FDH olarak belirlenmiştir. Bütün enzimlerden elde edilen hem hesapsal hem de deneysel sonuçlar kullanılarak; CtFDH için protein mühendisliğinde kullanılacak; fonksiyonel olduğu tahmin edilen amino asit pozisyonları belirlenmiştir. Seçilen bu beş (5) pozisyona protein mühendisliğinin yarı-rasyonel tasarım tekniği uygulandıktan sonra; elde edilen yaklaşık bin (1000) adet koloniden oluşan mutant kütüphanesi elde edilmiştir. Kütüphane tarandıktan sonra, kontrol yabanıl tip CtFDH'e göre yüksek aktivite gösteren dört (4) mutant biyokimyasal ve hesapsal olarak karakterize edilmiştir. Elde edilen mutant enzimlerden, yabanıl tip CtFDH'a göre yedi (7) kata kadar yüksek aktivite gösteren (Gly93HisIle94Tyr) mutant CtFDH elde edilmiştir. Proje sonunda elde karakterizasyonu yapılmış yüksek aktiviteli mutant CtFDH'ın yüksek hacimli üretimine dönük gerçekleştirilecek iyileştirme çalışmaları ile yüksek ticarileşebilecek katma değerli ürüne dönüşme potansiyeli bulunmaktadır. Ayrıca, projede gerçekleştirilen çalışmalardan üretilmiş çıktılar, benzer konularda yapılacak araştırmalar için değerli bir referans olacaktır.