Nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumunda (NETosis) DEK proteininin rolünün araştırılması

Abstract

DEK proteini ilk olarak kromozomal translokasyon sonucu DEK-NUP214 kimerik geni ile keşfedilmiştir. Yoğunlukla kromatine bağlı halde çekirdekte bulunmasına rağmen post translasyonel modifikasyonlar sonucu DNA'ya olan afinitesini kaybederek hücre dışınan aktif ve pasif olarak serbest ya da eksozomlar aracılığı ile salınır. Salgılanan DEK proteini nötrofiller ve T hücreleri için kemo-çekici fonksiyon gösterir. Aynı zamanda CXCR1/2 reseptörlerine bağlanabilen IL-8 (CXCL8) gibi kemokinlere benzer ELR motifi taşıyan DEK, hematopoietik kök hücrelerin proliferasyonunu CXCR2 aracılığı ile düzenler. Juvenil idiyopatik artirit hastalarının eklemlerinde bulunan DEK ve DEK oto-antikorları ile yapılan çalışmalarda Dek geni silinen farelerin nötrofillerinin özgün bir savunma mekanizması olan nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET) oluşturamadığı fakat rekombinant fare DEK (rDEK) muamelesinin bu özelliği geri kazandırdığı görülmüştür. Otoimmün hastalıklar dışında COVID-19'da da görev aldığı bilinen NET oluşumunda salgılanan DEK ve IL-8'in rolü bilinmemektedir. DEK proteininin sağlıklı insan nötrofillerinde NET oluşturma kapasitesi, rDEK ile uyarılan nötrofillerde immünofloresan boyama, morfolojik analizler ve NET ilişkili miyeloperoksidaz analizi yapılarak ilk kez bu tez çalışmasında gösterildi. rDEK ile uyarılan NET oluşumunun anti-DEK antikorları ve CXCR1/2 reseptörlerinin inhibitörü olan reparixin ile baskılandığı ve rDEK ile uyarılan NET oluşumunda CXCR1/2 reseptörlerinin rol oynadığı belirlendi. Ardından sağlıklı bireylerde (kontrol; n=60) ve hem akut (n=23) hem de konvalesan (n=45) evredeki COVID-19 hastalarının serumlarında DEK, inflamatuvar sitokinler ve NET belirteçlerinin konsantrasyonu ELISA yöntemiyle tespit edildi; incelenen sitokin ve NET belirteçleri arasında korelasyon olduğu (DEK proteini ile sağlıklı bireylerdeki IL-8, akut evre bireylerdeki IL-1? ve MPO, ve tüm COVID-19 hastaları beraber incelendiğinde MPO ile negatif; konvalesan evre bireylerdeki IL-1?, tüm COVID-19 hastaları beraber incelendiğindeki IL-6 ve IL-1? ile pozitif korelasyon) tespit edildi. Ayrıca, gerek sağlıklı insan nötrofillerinde gerekse COVID-19 hastalarının serumları veya rIL8 ile uyarılan nötrofillerde oluşan NETosis'te, DEK proteininin beklenin aksine çekirdekte değil, nötrofil elastaza benzer şekilde şekilde sitoplazmik granüllerde lokalize olduğu ve NET yapılarında ancak eser miktarda yer aldığı gösterildi. Son olarak COVID-19 hasta serumlarının sağlıklı nötrofillerde NETosisi uyarmasında DEK ve IL-8 konsantrasyonlarının belirleyici rol oynadığı ve NET oluşumunun anti-DEK ve anti-IL-8 antikorlarına ek olarak reparixin ile de baskılanabildiği gösterildi. Bu tez çalışması TÜBİTAK 120S979 projesi ile desteklenmiştir.DEK protein was first discovered through the DEK-NUP214 chimeric gene as a result of chromosomal translocation. Although it is mostly found in the nucleus bound to chromatin, DEK loses its affinity for DNA as a result of post-translational modifications and is released from outside the cell, actively or passively, and free or through exosomes. Secreted DEK protein functions as a chemoattractant for neutrophils and T cells. DEK, which carries an ELR motif similar to chemokines such as IL-8 (CXCL8), which can also bind to CXCR1/2 receptors, regulates the proliferation of hematopoietic stem cells through CXCR2. Interestingly, in studies conducted with DEK and DEK auto-antibodies found in the joints of Juvenile Idiopathic Arthritis patients, it was observed that neutrophils of mice with DEK gene deletion are unable to form neutrophil extracellular traps (NET), a neutrophil-specific defense mechanism, but mouse recombinant DEK (rDEK) treatment restored this feature. The role of secreted DEK and IL-8 in NET formation, which plays a role in COVID-19 as well as autoimmune diseases, is still unknown. In this thesis study, the NET-forming capacity of the DEK protein was demonstrated, first time, by stimulating NETosis with rDEK in healthy neutrophils evaluated morphologically by immunofluorescence staining, and enzymatically by NET-associated myeloperoxidase analysis. This effect was confirmed by suppressing rDEK-induced NET formation with anti-DEK antibodies and Reparixin which shows CXCR1/2 receptors play a role in rDEK-induced NET formation. Then, the concentration of DEK, cytokine, and NET markers in the serum of healthy individuals and COVID-19 patients in both acute and convalescent stages were determined by the ELISA method, and correlations were found between DEK and the examined cytokine and NET markers that could be associated with NET formation and prognosis of the disease. In addition, in COVID- 19 serum and rIL8-stimulated neutrophils, DEK protein, contrary to expectations, was found not in the nucleus but in the granules, showing a similar localization with neutrophil elastase, but it was observed that it did not participate in NET structures or was included in trace amounts. Finally, it has been shown that DEK and IL-8 concentrations play a decisive role in the stimulation of NETosis in healthy neutrophils of COVID-19 patient sera and that NET formation can be suppressed by reparixin in addition to anti-DEK and anti-IL-8 antibodies. This thesis work was supported by TUBITAK 120S979 grants.