Lipaz geninin termofilik Geobacillus kaustophilus'tan klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Geobacillus kaustophilus'ta bulunan tahmini lipaz geni uygun primerler ile PCR kullanılarak çoğaltılmıştır. PCR ürünleri NdeI ve HindIII enzim kesim bölgeleri kullanılarak pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlanan lipaz geninin dizisi, dizi analizi ile kontrol edilmiştir. Lipaz genini içeren pET28a(+) ekspresyon vektörü, E.coli BL21(DE3) kompetan hücreleri transforme edilmiştir. Rekombinant lipaz ekspresyonu IPTG uyarımı ile yapılıp Ni-NTA afinite kolonu kullanılarak saflaştırması yapılmıştır. His-tag kuyruğu içeren rekombinant lipaz SDS-PAGE analizi yapılarak yaklaşık 45 kDa büyüklüğünde olduğu belirlenmiştir. Elde edilen rekombinant protein, lipaz aktivitesi göstermiştir. Rekombinant lipazın karakterizasyon ölçümleri spektrofotometrik analizler ile pNP türevleri ve hindistan cevizi yağına karşı yapılmıştır. His-tag füzyon lipaz ve his-tag bölgesi içermeyen lipazın optimum sıcaklığı gam arabik içeren reaksiyon ortamında sırasıyla 30 ve 50oC olarak belirlenmiştir. Rekombinant lipaz enzimi maksimum aktivitesi pH 8.0, aktivite kararlılığı ise en yüksek pH 8.5'te gözlemlenmiştir. Gk-lipaz enzimi substrat seçiciliği deneylerinde ise orta uzunluktaki sentetik substratları daha iyi hidroliz ettiği belirlenmiştir. Buna benzer olarak bitkisel yağlarla yapılan aktivite deneylerde ise yapısında çoğunlukla C-10 ve C-12 içeren hindistan cevizi yağının lipaz tarafından hidrolizinin diğer yağlara göre daha fazla olduğu belirlenmiştir. DTT ve PMSF içeren reaksiyon ortamında lipaz aktivitesinin sırasıyla %22 ve %33 oranında inhibe edildiği gözlemlenmiştir.In this study, a putative lipase gene in the genome of Geobacillus kaustophilus was amplified using PCR with appropriate primers. The PCR product was cloned into the NdeI and HindIII cloning sites of pET28a(+) expression vector. Its DNA sequence was confirmed by DNA sequencing. The pET28a(+) vector containing the lipase gene was transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The overexpression of the recombinant lipase was achieved by IPTG induction and it was purified by using Ni-NTA affinity column. The molecular weight of the recombinant lipase including his-tag tail was determined as nearly 45 kDa on SDS-PAGE analysis. The recombinant enzyme showed lipase activity. The activity experiment of the recombinant lipase was determined using a spectrophotometric assay against p-NP derivatives and coconut oil. Optimum temperature for his-tag fusion lipase and lipase lack of his-tag tail activity with gum arabic was observed at 30 oC and 50oC respectively. Recombinant lipase enzyme showed maximum activity pH 8.0 and was stable at pH 8.5. With the use of p-NP derivatives as substrates, Geobacillus kaustophilus lipase exhibit high activity with C-10 and C-12 acyl groups. Like synthetic specificity, the study of real oil indicated that preferential substrate of Gk-lipase hydrolysis is coconut oil having more C-10 and C-12 group. G.kaustophilus lipase activity was inhibited by DTT and PMSF approximately 22% and 33%, respectively.