The effect of site directed mutations on the activity of NAD+ - dependent formate dehydrogenases

Abstract

Format dehidrogenazlar (FDH), formatın karbon dioksite tersinir oksidasyonunu katalize ederler; ileri reaksiyonda format iyonunu CO2'e oksitlerken, NAD+'ı, NAD(P)H'ye indirgemektedir. Ayrıca tersinir reaksiyon aynı zamanda CO2'i indirgeyerek NAD(P)H'nin NAD+ 'ya oksitlenmesini sağlamaktadır. Ancak NAD+ bağımlı FDH'ler, CO2'nin indirgenmesi için düşük katalitik verimlilik göstermektedirler. Ek olarak, kofaktörlerin rejenerasyonu, FDH'lerin aşırı işlem koşullarında kararlı ve yüksek katalitik aktiviteye sahip olmasını gerektirmektedir. Bu enzimlerin, CO2'nin hidrokarbonlara dönüştürülmesi ve daha verimli kofaktör rejenerasyon eldesi açısından endüstriyel ölçekte kullanılabilmeleri için bu enzimlerin yeniden tasarlanmaları gerekmektedir. Amino asitlerin Chaetomium thermophilum (CtFDH) ve Ceriporiopsis subvermispora (CsFDH) format dehidrogenazların katalitik özellikleri ve termal kararlılığı üzerindeki etkileri, literatür ile karşılaştırıldığında ilginç sonuçlar ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, bu çalışma, spesifik mutasyonların seçilen FDH enzimlerinin, kinetik özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmak için tasarlanmıştır. Seçilen FDH'ler iyi bilinen FDH'ler ile birlikte hizalanmıştır ve aktif bölgeye göreceli yakınlıklarına göre mutasyon için dört hizalı olmayan amino asit seçilmiştir. Kinetik değerler analiz edilmiştir ve substrat bağlama bilgesinin yapısal analizleri homoloji modellemesi ile yapılmıştır. En güçlü etki HCO3'e karşı CsFDH Val313Pro'da gözlemlenmiştir. Substrat ve koenzim için CsFDH Val313 enziminin KM değeri az oranda azalmıştır ayrıca aktivitesi, doğal tipten neredeyse üç kat daha yüksektir. Mutant CtFDH ve CsFDH'lerin sonuçlarının analizleri, literatür ile karşılaştırıldığında CO2 indirgenmesinde bazı umut verici sonuçlar göstermektedir.Formate dehydrogenases (FDH) catalyze the reversible oxidation of formate to carbon dioxide; in the forward reaction it oxidizes formate ion to CO2 while reducing NAD+ to NAD(P)H. Also, the reverse reaction of FDHs reduces CO2 to formate simultaneously oxidizing NAD(P)H to NAD+. However, NAD+-dependent FDHs show low catalytic efficiency for the reduction of CO2. Besides, regeneration of cofactors requires that FDHs have stability in extreme process conditions and high cofactor turnover rates. These enzymes would need to be engineered before they could be used at an industrial scale for the conversion of CO2 to hydrocarbons and to have more efficient cofactor regeneration. The effects of amino acid changes on catalytic properties and thermal stability of Chaetomium thermophilum (CtFDH) and Ceriporiopsis subvermispora (CsFDH) formate dehydrogenases revealed some interesting results compared the literature. Therefore, this study was designed to investigate the effects of specific mutations on the kinetic properties of selected FDH enzymes. The selected enzymes were aligned with well-known FDHs and four non-aligned residues were selected for mutation based on their relative proximity to the active site. The kinetic values were analysed and structural analyses of the substrate-binding site were done by homology modelling. The strongest effect was observed in CsFDH Val313Pro against HCO3–. The KM value of the CsFDH Val313 enzyme for substrate and coenzyme slightly decreased, and its activity is almost three-fold higher than the wildtype. Analyses of results of mutant FDHs give some promising results for CO2 reduction compared to the literature.