Floresan protein işaretli CCDC124 proteininin hücresel lokalizasyonu ve stres şartlarında hücre altı translokasyonu

Abstract

Coiled-coil domain containing 124 (CCDC124) ökaryotlarda yüksek korunmuşluğa sahip bir gendir. Bu genin insanlarda kodladığı CCDC124 proteini 32 kDa olup, 223 amino asit uzunluğundadır. Daha önce yapılan çalışmalarda bu proteinin ribozomal bir protein olduğu ve düşük karmaşıklık bölgeleri (Low complexity regions- LCR) bölgeleri içerdiği gösterilmiştir. Çift özgüllük tirozin fosforilasyonu düzenlenmiş kinaz 3 (Dual Specificity Tyrosine Phosphorylation Regulated Kinase 3-DYRK3), DYRK ailesinden bir proteindir ve stres granül belirtecidir. Hücre içerisinde stres granülleri oluşumunda büyük bir etkiye sahiptir ve hücrenin fizyolojik işleyişinde görev alır. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalarda CCDC124'ün hücre içerisindeki lokasyonu, stres şartlarındaki hücre altı translokasyonu ve bunun DYRK3 ile bağlantısının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla CCDC124'ü hücre içerisinde görüntülemek için, CCDC124'ün N terminaline HALOtag ve SNAPtag ya da C terminaline GFP floresan protein füzyon edilecek şekilde ilgili plazmitlere klonlanmış olup U2OS, HEK293T, HCT116 ve HeLa hücrelerinde görüntüleme yapılmıştır. Viral enfeksiyon benzeri, oksidatif ve ozmotik stresler uygulanmıştır. Stres belirteci olarak ise DYRK3 kullanılmış ve hücrelere DYRK3 inhibitörü olan GSK626616 uygulanarak CCDC124 proteini üzerideki etkisine bakılmıştır. Strese yol açan maddelerin uygulamasından sonra sonuçlar Konfokal 780/880/980 ve Lattice Lightsheet 7 (LLSM7) mikroskopları kullanılarak değerlendirilmiştir. Görüntülemeler sonucunda CCDC124 proteininin sitoplazmada yaygın, bazen granüler yapılarda olduğu ve çekirdekçikte Fibrillarin 7 proteini ile etkileştiği gözlemlenmiştir. Ayrıca Fibrillarin 7'nin sitoplazmada oluşturduğu agrezomlarda da CCDC124 ile beraber oldukları görülmüştür. Bununla beraber CCDC124'ün mitokondri ile lokalize ve/veya etkileşen bir protein olduğu sonucuna varılmıştır.Coiled-coil domain containing 124 (CCDC124) is a highly conserved gene in eukaryotes. The CCDC124 protein encoded by this gene in humans is 32 kDa and is 223 amino acids long. Previous studies have shown that this protein is a ribosomal protein and contains low complexity regions (LCR). Dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 3 (Dual Specificity Tyrosine Phosphorylation Regulated Kinase 3-DYRK3) is a protein from the DYRK family and is a stress granule marker. It has a great effect on the formation of stress granules in the cell and takes part in the physiological functioning of the cell. In the studies carried out within the scope of this thesis, it was aimed to determine the location of CCDC124 in the cell, its subcellular translocation under stress conditions and its connection with DYRK3. For this purpose, to display CCDC124 in the cell, HALOtag and SNAPtag to the N-terminus or GFP fluorescent protein to the C-terminus of CCDC124 were cloned into the corresponding plasmids and imaging was performed in U2OS, HEK293T, HCT116 and HeLa cells. Viral infection-like, oxidative, and osmotic stresses were applied. DYRK3 was used as a stress marker and its effect on CCDC124 was examined by applying GSK626616, a DYRK3 inhibitor, to the cells. After application of stressors, the results were evaluated using Confocal 780/880/980 and Lattice Lightsheet 7 (LLSM7) microscopes. As a result of the imaging, it was observed that the CCDC124 protein is widespread in the cytoplasm, sometimes in granular structures, and interacts with the Fibrillarin 7 in the nucleolus. In addition, it was observed that they were associated with CCDC124 in agresomes formed by Fibrillarin 7 in the cytoplasm. However, it was concluded that CCDC124 is a protein that localizes and/or interacts with mitochondria.