Studies on testing polyphosphate deficient Streptomyces coelicolor as a host for homolog and heterologous expression of valuable products

Abstract

Streptomyces'ler Gram-pozitif, filamentli, DNA'larında yüksek G-C oranına sahip toprak bakterileridir. Yakın zamanlı çalışmalar genomlarındaki kriptik biyosentetik gen kümeleri sayesinde çok daha çeşitli ikincil metabolit üretme potansiyeline sahip olduklarını göstermiştir. Laboratuvarımızda yürütülen bir çalışmada, genomdan polifosfat üretiminden sorumlu olan polifosfat kinaz (ppk) geninin silinmesiyle hem Streptomyces coelicolor'te aktinorhodin antibiyotiğinin üretiminin arttığı gösterilmiştir. Böylece ppk geninin silinmesi, güçlü bir endojen antibiyotik üreticisi olan bir S. coelicolor mutant suşu oluşturmuştur. Çalışmamız kapsamında, S. coelicolor ?ppk suşunun birincil metabolitleri de daha çok üretip üretmeyeceğini veya heterolog ifade konağı olarak olası bir prototip olup olmayacağını araştırdık. Bu nedenle, birincil metabolizmayı test etmek için kolesterol oksidazı, S. coelicolor yaban tip ve ?ppk'daki heterolog ifadeyi test etmek ve karşılaştırmak için de bir anti-tümör ajanı olan 8-demetil tetrasenomisini (8-DMTC) seçtik. Deneylerin sonucunda, S. coelicolor'ın olası kolesterol oksidaz geni başarıyla klonlandı ancak besiyerine eklenmesi gereken substrat (kolesterol) olmadığından polifosfat eksikliğinin enzim üretimine etkisi belirlenemedi. Heterolog ekspresyon deneylerinde, S. coelicolor ?ppk rekombinant suşun yaban tip rekombinantına göre 8-DMTC'yi biraz daha fazla ürettiği gözlendi. Bunun yanında, rekombinantların koloni formasyonunda 8-DMTC üretiminden kaynaklanan morfolojik değişiklikler olduğu tespit edildi. Rekombinant S. coelicolor yaban tip ve ?ppk suşlarının koloni, pelet ya da topak oluşturmadıkları, ayrıca yaban tip ve ?ppk suşun aksine pigmentli antibiyotikleri üretmedikleri ve sporlanamadıkları gözlendi. 8-DMTC'nin üretilmesi sebebiyle S. coelicolor kolonilerindeki ilginç morfolojik değişiklikler daha önce rapor edilmemiş olduğundan çalışmamız literatüre değerli bilgiler sağlamıştır.

Streptomycetes are Gram-positive, filamentous soil-dwelling bacteria with high G-C content. Recent studies indicated that they have a high potential to produce more variety of secondary metabolites thanks to their cryptic biosynthetic gene clusters in their genomes. A previous study carried out in our laboratory showed that the deletion of polyphosphate kinase gene (ppk), responsible for polyphosphate biosynthesis, increased the production of actinorhodin in both Streptomyces coelicolor strains. So, the deletion of the ppk gene created S. coelicolor mutant strain with a strong endogenous antibiotic production capacity. In the scope of the present study, we investigated whether the S. coelicolor ?ppk strain could also produce primary metabolites in high amounts or be a possible prototype as a heterologous expression host. For that reason, we have selected cholesterol oxidase to determine the effect of ppk deletion on primary metabolism and the 8-demethyl-tetracenomycin (8-DMTC), an anti-tumor agent, to study the potential of ?ppk strain as a host for the heterologous expression. We have successfully cloned the putative cholesterol oxidase gene of S. coelicolor, but the effect of polyphosphate deficiency on enzyme production couldn't be determined because of the lack of substrate (cholesterol) that must be supplemented into the medium. In the case of heterologous expression experiments, the 8-DMTC expressing recombinant S. coelicolor ?ppk strain produced slightly more 8-DMTC than the recombinant wild type. Besides, we have noticed morphological changes in the colony formation of the recombinants caused by the production of 8-DMTC. The recombinant S. coelicolor wild type and ?ppk strains can not form colonies, pellets or clumps. Moreover, they can not produce pigmented antibiotics and do not sporulate, unlike wild type and ?ppk. Our study provided valuable information to the literature since the interesting morphological changes of the S. coelicolor colonies caused by the expression of 8-DMTC have not been reported before.