MiR396 knockout via crispr to enhance expression levels of growth regulating factors (GRFS) in tomato

Abstract

MikroRNA'lar genellikle 21-24 nükleotid uzunluğundan oluşan kodlama yapmayan küçük RNA'lardır. Oldukça hedefe özgü olmakla birlikte bitkilerde gen regülasyonu üzerinde kritik rollere sahiptirler. MiR396, bitkiler arasında oldukça korunmuş olan miRNA'lardan biridir ve çeşitli bitki türlerinde 60 üyeye sahiptir. Şu an için domateste miR396'nın sadece 2 üyesi tanımlanmıştır, miR396a/b ve bitkiler üzerinde benzer isimlere ve benzer etkilere sahip olsalarda her biri farklı kromozomlarda ifade edilmektedir. Bu tezde, miR396 biogenezini durdurarak GRF'lerin ifadelerini artırmak hedeflenmiş ve miR396b biogenez inhibisyonu için çift guide RNAli CRISPR/Cas9 protokolü tasarlanıp bu protokolün domates için optimize edilmesi planlanmıştır. Arabidopsis'te ve domatesde miR396b GRF'leri hedeflediğinden, bu miRNA bitki büyümesi ve gelişmesi, hücre çoğalmasının düzenlenmesi, meristem ve yaprakların boyutu ve stoma sayısı üzerinde doğrudan etkiye sahiptir. Bundan dolayı, CRISPR aracılığı ile miR396b'nin tam olarak susturulması domates bitkisinde olumlu sonuçlar doğurup geliştirilmiş bitki ıslahı sağlaması ile birlikte, fizyolojik gelişmelere yol açtığından sonuçların analizi ve sonuçlara ilişkin kararların alınmasını daha kolay hale getirmiştir. CRISPR ile geliştirilen mahsuller GDO'dan (Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar) ziyade GEO (Genetiği Düzenlenmiş Organizmalar) olarak kabul edildiğinden, bitki ıslahı için CRISPR tabanlı protokollerin geliştirilmesi literatürde zaten büyük önem taşımaktadır. Bu tezde, dizileme ve fenotipleme yoluyla 11 transgenik bitkiden 2 mutant bitki tespit ettik. Mutant bitkiler sürgün büyümesinde önemli gelişme göstermiştir. Mutant bitkiler ortalama 207 cm sürgün uzunluğuna sahipken, yabani tip bitkiler ortalama 167.5 cm sürgün uzunluğuna sahiptir. Her ne kadar bitki ıslahı öncelikli amaç olsa da bu CRISPR-miRNA imha protokolü, gelecekte sadece bitki iyileştirme çalışmalarında kullanılmakla kalmayacak, aynı zamanda domates üzerinde fonksiyonel araştırmalar için de faydalı bir araç olacaktır.MicroRNAs are small non-coding RNAs and generally 21-24 nucleotides in length. Besides being highly target-specific, miRNAs also have critical roles in gene regulation in plants. MiR396 is one of the highly conserved miRNAs among plants and has more than 60 members in various plant species. Currently, 2 members of miR396 family are classified in tomato plant, miR396a/b. They have similar sequences and targets in tomato plants. In this thesis, it was aimed to increase the expression of GRFs by inhibiting the miR396 biogenesis and for that CRISPR/Cas9 protocol with double guide RNAs was designed for tomato plants. Because miR396b form miRNA/target module with GRFs, miR396b has regularity role on various plant developmental mechanisms, such as plant growth and cell proliferation. Therefore, silencing miR396b via CRISPR lead to positive physiological results in tomato plants, and those physiological improvements allowed us to analyse the results easier. The development of CRISPR-based protocols for plant breeding is already of great importance in the literature, as crops developed with CRISPR are considered GEOs (Genetically Edited Organisms) rather than GMOs. In this thesis, we detected 2 mutant plants from 11 transgenic plants through sequencing and phenotyping. Mutant plants (MP) shown significant improvement on shoot growth. MPs averagely had 207 cm shoot length, on the other hand WT had 167.5 cm. Although plant breeding is the primary goal, this CRISPR-miRNA protocol will not only be used in plant improvement studies in future but will also be a useful tool for functional research on tomatoes.