Effect of amino acid positions located on linked region on Chaetomium thermophilium formate dehydrogenase (CtFDH) activity

Abstract

Oksidoredüktaz enzim grubu içerisinde yer alan dehidrogenaz enzimleri optikçe aktif maddelerin sentezlenmesinde görevlidirler. Nikotinamid adenin dinükleotit Format Dehidrogenaz (NAD+)-bağımlı FDH) formatı substrat olarak kullanarak CO2'e dönüşmesini katalizlerken, NAD+'i NADH formuna indirger. FDH enzimleri NADH rejenerasyonu açısından da endüstriyel ve kimyasal alanda kullanılan bir enzim haline gelmiştir. Son zamanlarda, Chaetomium thermophilum FDH (CtFDH) enziminin de CO2'nin formata indirgenmesinde yüksek potansiyele sahip olduğu keşfedilerek çalışmalar yapılmıştır. Bu tez çalışması ile amacımız, NAD+-bağımlı CtFDH enzimininin protein mühendisliği yöntemlerinden birisi olan yönlendirilmiş bölge mutagenez yöntemi ile üretilmesi, enzim aktivitesi ve termostabilitesinin artırılmasıdır. Çalışmada, CtFDH protein geni üzerinde Glu164Ala ve Asp188Arg mutasyonlarını içeren primerler tasarlanmıştır. Bu dejenere primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yapıldı. Mutant Glu164Ala ve Asp188Arg CtFDH'lerin enzim aktivite ve thermostabilite ölçümleri yapılmak üzere, elde edilen proteinler afinite kromotografisi yöntemi kullanılarak Ni-NTA HisTrap kolonları ile moleküler düzeyde saflaştırıldı. Saf enzimlerin karakterizasyonu için yapılan çalışmalarda yabanıl tip ile karşılaştırıldığında Glu164Ala mutasyonunun sodyum formata karşı spesifik aktiviteyi ve termostabiliteyi artırdığı ve Asp188Arg mutasyonunun sodyum formata karşı spesifik aktiviteyi düşürdüğü termostabiliteyi artırdığı ve sodium bicarbonata karşı spesifik aktiviteyi ve termostabiliteyi artırdığını göstermiştir. Bu tez çalışması, akademik alanda ve endüstriyel proseslerde kullanım alanı olan NAD+-bağımlı FDH enziminin aktivitesinin artırılması ve büyük ölçekte üretilebilmesinde veri sağlanması açısından önemlidir.Dehydrogenase enzymes, which are in the oxidoreductase enzyme group, are responsible for the synthesis of optically active substances. Nicotinamide Adenine Dinucleotide-dependent Formate Dehydrogenase (NAD+-dependent FDH) uses formate as a substrate to catalyze its conversion to CO2 while reducing from NAD+ to NADH. FDH enzymes have become an enzyme used in industrial and chemical fields in terms of NADH regeneration. Recently, studies have been carried out by discovering that the enzyme Chaetomium thermophilum FDH (CtFDH) also has a high potential in the reduction from CO2 to formate. Our aim in this thesis is to increase the enzyme activity and thermostability of the NAD+-dependent CtFDH by site directed mutagenesis method which is one of the protein engineering technics. In the study, primers containing codons of Glu164Ala and Asp188Arg CtFDH mutations were designed. Polymerase chain reaction (PCR) was performed with these degenerate primers. In order to measure the enzyme activity and thermostability of the mutant Glu164Ala and Asp188Arg CtFDHs, were purified at molecular level with Ni-NTA HisTrap columns using affinity chromatography method. Studies conducted for the characterization of pure enzymes have shown that Glu164Ala mutation increases specific activity and thermostability towards sodium formate, and that the Asp188Arg mutation decreases specific activity towards sodium formate, increases thermostability and increases specific activity and thermostability towards sodium bicarbonate compared to wild type. This thesis study is important in terms of increasing the activity of NAD+-dependent FDH enzyme, which is used in the academic field and industrial processes, and providing data for its production on large scale.