Heterolog antosiyanin biyosentezinde petunia hybrida an9 glutatyon transferazının rolü

Abstract

Antosiyaninlerin eldesi, günümüzde hâlâ büyük ölçüde bitkilerden ekstraksiyona dayanmaktadır. Ancak bitkilerin görece yavaş büyümesi, tarım arazisine bağımlılık ve zahmetli, tahrip edici ekstraksiyon yöntemleri bu bileşiklerin yüksek maliyetle üretilmeleri ile sonuçlanmaktadır. Öte yandan mikrobiyal temelli üretim, antosiyanin biyosentezinde daha sürdürülebilir ve çevre dostu bir alternatif sunmaktadır. Günümüze kadar heterolog antosiyanin biyosentezi Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lactis ve Saccharomyces cerevisiae'de rapor edilmiştir. Yapılan tüm çalışmalara rağmen antosiyanin üretimi istenilen seviyeye ulaşamamıştır. Bu nedenle, heterolog antosiyanin üretiminde farklı stratejilerin geliştirilmesi gerekmektedir. Literatürde, 2023 yılında mayada yapılan bir çalışmada, glutatyon S-transferaz (GST) enzimlerinin antosiyaninlerin taşınması işlevine ek olarak, biyosentez basamağında lökoantosiyanidinlerin son derece kararsız yapıdaki antosiyanidine dönüşmesinde merkezi bir rol oynadığı ve antosiyanin üretim verimini yapılan denemelerde 36,5 kata kadar arttırdığı kanıtlanmıştır. Bu tez çalışmasında GST'lerin bu etkisinin bakteriyel kaynaklardaki etkisinin belirlenebilmesi için mikrobiyal konakçı olarak E. coli seçilmiş ve PhAN9 (Petunia hybrida AN9) glutatyon S-transferaz gen (GST) ekspresyonunun antosiyanin üretimine olan etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, antosiyanin taşınması ve birikmesinde önemli işleve sahip PhAN9 glutatyon transferaz geni alınıp E. coli'de daha önce tasarlanmış olan antosiyanin üretici hücrelere klonlanmıştır. Bu rekombinant hücreler, siyanidin 3-O-glukozit (C3G) adı verilen kırmızı renkli bir pigment üretmektedir. Antosiyanin üretiminin optimizasyonu için farklı karbon ve nitrojen kaynakları, IPTG konsantrasyonu ve uyarım zamanları, havalandırma oranı, inokulum oranı ve kültür toplama zamanları denenmiştir. Yapılan optimizasyonlar sonrasında, en yüksek antosiyanin oranı E. coli'de PhAN9 genini taşıyan GST rekombinantı hücrelerde (72 mg/L), C3G rekombinantı hücrelere (13.7 mg/L) görece yaklaşık 5 kat artış olarak gözlemlenmiştir. Yapılan optimizasyon çalışmalarında, görece düşük glikoz varlığında ve düşük IPTG konsantrasyonunda daha yüksek C3G verimi elde edilmesi, ticari ölçekte önemli bir avantaj sağlayacaktır. E. coli'de heterolog antosiyanin üretimine GST genlerinin klonlanması ile ilgili bu stratejinin daha önce uygulanmamış olması bu çalışmanın özgünlük değerini arttırmaktadır. Elde edilen sonuçlar, endüstriyel anlamda antosiyanin üretici soyların geliştirilmesi ve bu pigmentlerin gıda ve nutrasötik sektörlerde sürdürülebilir üretimi için biyosentetik anlamda önemli bilgiler sunmaktadır.Currently, the production of anthocyanins still relies largely on extraction from plants. However, the relatively slow growth of plants, dependence on agricultural land, and labor-intensive, destructive extraction methods result in high production costs for these compounds. On the other hand, microbially based production offers a more sustainable and environmentally friendly alternative for anthocyanin biosynthesis. To date, heterologous anthocyanin biosynthesis has been reported in Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lactis, and Saccharomyces cerevisiae. Despite all efforts, anthocyanin production has not yet reached the desired levels. Therefore, alternative strategies need to be developed for efficient heterologous anthocyanin production. According to a study conducted in yeast in 2023, glutathione S-transferase (GST) enzymes were shown to play a central role not only in the transport of anthocyanins but also in the biosynthetic conversion of highly unstable leucoanthocyanidins into anthocyanidins. In the experiments, this modification led to an increase in anthocyanin production yield by up to 36.5-fold. In this thesis study, E. coli was selected as the microbial host to determine the contribution of GSTs in bacterial systems and effects of PhAN9 (Petunia hybrida AN9) glutathione S-transferase gene expression was investigated on anthocyanin production. For this purpose, the PhAN9 gene, which plays a significant role in anthocyanin transport and accumulation, was cloned into previously engineered anthocyanin-producing E. coli strains. These recombinant cells produce a red-colored pigment known as cyanidin 3-O glucoside (C3G). To optimize anthocyanin production, various parameters were tested, including different carbon and nitrogen sources, IPTG concentrations and induction times, aeration rates, inoculation ratios, and culture harvesting times. Following these optimization experiments, the highest anthocyanin concentration was obtained in the PhAN9-expressing GST recombinant strain (72 mg/L), representing approximately a 5-fold increase compared to the C3G-producing control strain (13.7 mg/L). Furthermore, it was observed that under relatively low glucose concentrations and low IPTG levels, higher C3G yields could be achieved, which may offer a significant advantage for commercial-scale applications. The implementation of GST gene expression as a strategy for heterologous anthocyanin production in E. coli has not been previously reported, which adds to the originality of this study. The findings provide valuable biosynthetic insights for the development of industrially viable anthocyanin-producing strains and support the sustainable production of these pigments for use in the food and nutraceutical industries.