Rekombinant Escherichia coli soylarında penisilin asilaz ekspresyonunun akılcı tasarım ile iyileştirilmesi

Abstract

Penisilin asilaz (PA) yarı sentetik antibiyotiklerin üretimi sürecinde penisilin G'den 6-aminopenisillanik asit üretmede kullanılan endüstriyel olarak önemli bir enzimdir. E. coli'nin periplazmasında PA'nın olgunlaşması için translokasyon ve periplazmik işlenme/katlanma adımlarını içeren prokaryotik proteinlerde pek görül-meyen bir takım translasyon sonrası basamaklar gereklidir. Enzimin üretimi pac geni ekspresyonunun çeşitli adımlarıyla ilgili tamamlanmamış genetik bilgi nedeniyle hala sınırlı olduğundan, PA üretimini artıracak etkili ekspresyon stratejilerinin gel-iştirilmesi önemlidir.Bakterilerde translasyonun başlaması genellikle translasyonun hız-sınırlayıcı basamağı olarak göz önünde tutulmakta olup, bir genin ekspresyon düzeyinin belir-lenmesinde temel bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada pac geni translasyona başlama bölgesinde (TIR) tercih edilen nükleotit tipi ve pozisyonlarını belirlemek amacıyla bu bölgeye bazı mutasyonlar yerleştirilmiştir. Mutasyonların oluşturulmasında PCR mutagenez yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen mutantların tamamı 26 °C'ta yaban tipe görece daha yüksek bir enzim aktivitesi verirken; 37 °C'ta pac mRNA'sının sı-caklığa duyarlı translasyonu değişmemiştir. Bu sonuç pac geni yaban tipi dizisinin maksimum ekspresyonu sağlamadığına ve translasyona başlama bölgesinin nükleotit içeriğinde yapılacak değişikliklerin aktif PA üretimini iyileştirilebileceğine dikkat çekmiştir. Uyarımlı ve konstitütif olarak gerçekleştirilen ekspresyon çalışmalarında, enzim aktivitesi sadece IPTG uyarımlı koşullarda ve pac3.5-kb fragmanını taşıyan klonları içeren rekombinant soyların kullanıldığı durumda elde edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada beklenmedik bir şekilde daha önce bildirilenlerin aksine PA'nın pe-riplazmaya taşınması için sadece Twin arginin translokasyon yolağına gereksinim duymadığı da gösterilmiştir.Penicillin G acylase is an industrially important enzyme for production of 6-aminopenicillanic acid from penicillin G during the manufacturing of semisynthetic antibiotics. Formation of mature PA in the periplasm of E. coli involves a series of post-translational steps including translocation and periplasmic processing/folding steps, which are unique for prokaryotic proteins. Production of PA is still limited mainly due to the incomplete genetic information existing on various steps of pac gene expression and therefore, it is important to develop efficent expression strate-gies in order to enhance PA production.Initiation of translation in bacteria is generally considered as a rate-limiting step of translation and it has main role on determination of the overall expression level of a gene. In this work, some mutations are introduced into translation initiation region (TIR) of pac gene in order to identify the prefered nucleotides and positions in this region. Mutations were performed by PCR-mutagenesis. All of the mutants gave higher level of enzyme activity in comparison to wild-type sequence at 26 °C while no change occured in the temperature-sensitive translation of pac mRNA at 37 °C. This result indicates that wild-type pac gene sequence does not give maximum level of gene expression and alteration of the nucleotide context of TIR of pac gene could improve the active enzyme production.Enzyme activity was only found in strains that contain clones carrying pac gene in 3.5-kb fragment with IPTG induction conditions in expression studies that were carried out constitutively and by induction. Unexpectedly, our study also re-vealed that translocation of PA, in contrast to earlier reports, did not require only the Twin-arginine translocation pathway for its transport into the periplasm.