Coiled-coil domain containing 124 (CCDC-124) proteinine özgü monoklonal antikor saflaştırılması, immün boyama ve biyokimyasal metotlar ile analizi

Abstract

CCDC-124 (Coiled-coil domain-containing 124) memeli hücrelerinde işlevi yeni açığa çıkmakta olan proteindir. Bu proteinin bazı hücre hatlarındaki hücre içi lokasyonu, hücre döngüsünün interfaz evresinde sentrozom; mitozun post-anafaz, telofaz ve sitokinez evrelerinde ise orta-cisimcik (midbody) olarak belirlenmiştir [1]. Geçmişte yapılan bilimsel çalışmalarda CCDC-124 proteini kodlayan genin susturulması durumunda hücreler üzerinde meydana gelen değişiklikler kısmi olarak araştırılmış ve bu durumun hücrelerin tam olarak bölünememesi ile sonuçlandığı ve çok çekirdekli hücrelerin meydana gelmesine neden olduğu ortaya konulmuştur [2]. CCDC-124 proteinin hücre içindeki işlevinin açığa çıkması amacıyla hibridoma teknolojisi kullanılarak CCDC-124 proteinine özgü hibridomalar üretilmiştir [3]. Yapılan bu tez çalışmasında ise özgüllüğü en yüksek olan 4B3 hibridoma klonu, affinite kromatografi tekniği kullanılarak monoklonal antikorlar saflaştırılmıştır.4B3 hibridoma klonundan saflaştırılan monoklonal antikorlar, His işaretli kolon ile saflaştırılan saf CCDC-124 proteini ve HeLa hücre hattından alınan lizatlarla ile birlikte Western Blotting ile analizi yapılmıştır. Yapılan bu analizde, kullanılan monoklonal antikorlar ile CCDC-124 proteininin 35 kDa ve 15 kDa civarında iki ayrı izoformu gözlemlenmiştir. CCDC-124'ün hücre içindeki lokalizasyonuna ilişkin yapılan immün boyama analizinde ise RPE PLK-1 GFP hücre hattında monoklonal antikorlar denenmiştir. Monoklonal antikor ile yapılan immün boyama çalışmalarında CCDC-124 proteinin, PLK-1 ile kolokalizasyonuna rastlanmış olup her ikisinin de sentrozomdaki lokasyonu görülmüştür.The exactly role of CCDC-124 (Coiled-coil domain containig 124) protein is poorly defined up to date. In some of the cell lines, it has been determined that during interphase, CCDC-124 is located inside the centrosome; while during mitosis, specifically post-anaphase, telophase, and cytokinesis, the protein is located at the midbody [1]. It has previously been shown that when the gene that encodes for the protein CCDC-124 is silenced, the cells failed to divide, which resulted in multinucleated cells [2]. In order to elucidate the precise role of CCDC-124 in the cells, hybridoma cells that are unique to CCDC-124 are generated [3]. In this study, the 4B3 monoclonal antibodies, which have very high specificity for CCDC-124 protein, obtained from the mice are purified via affinity chromatography. These purified 4B3 monoclonal antibodies along with purified CCDC-124 and the lysates obtained from the Hela cells, are used for western blotting. The western blotting results showed that the CCDC-124 protein was consist of two separated bands as 15kDa and 35kDa. Afterwards, in order to detect the cellular localization of CCDC-124 protein, the 4B3 monoclonal antibodies are used in RPE-PLK1 GFP cell lines by applying immunostaining technique. The immunostaining results demonstrated that the CCDC-124 protein is co-localized with polo-like kinase 1 (PLK-1), which verified the presence of CCDC-124 inside the centrosome.