Exploring period2 interactome

Abstract

Sirkadiyen saat, metabolizmayı ve fizyolojiyi ~24 saatlik döngüsel bir şekilde kontrol etmek için aydınlık-karanlık döngüleriyle senkronize edilir. Endojen sirkadiyen saat, bir transkripsiyon-translasyon geri bildirim döngüsü (TTFL) mekanizması tarafından üretilir ve güneş ışığı ile 24 saatlik jeolojik saate göre ayarlanır. TTFL'nin pozitif kolunda BMAL1 ve CLOCK transkripsiyon faktörleri, negatif kol üyeleri PERIOD (PER) ve CRYPTOCHROME (CRY) ile diğer sirkadiyen saat tarafından düzenlenen genlerin transkripsiyonunu aktive eder. Translasyon sonrası, CRY ve PER proteinleri, protein-protein etkileşimleri (PPI'lar) ile BMAL1- CLOCK aktivitesini inhibe eder. İnsanlardaki üç PER proteini arasında en yüksek salınımı gösteren PER2 proteini sitoplazmada ve çekirdekte sirkadiyen bir şekilde bulunur. Bu nedenle, proteinlerin PER2 ile etkileşimini araştırmak önemlidir. Laboratuvarımız, BioID yöntemlerini kullanarak PER2'nin yeni PPI'larını keşfetti. Bu çalışmanın amacı, koimmünopresipitasyon tekniğini kullanarak PER2'nin PPI'larından bazılarını doğrulamaktır. Bu amaçla, FLAG-PER2'yi kararlı bir şekilde ifade eden HEK293T hücrelerinde HA etiketli interaktörleri geçici olarak eksprese ettik. FLAG-PER2 ile etkileşime giren proteinler, anti-FLAG antikoru kaplı manyetik boncuklar üzerine çekildi ve spesifik olmayan şekilde bağlananlar yıkama ile uzaklaştırıldı. Anti-FLAG antikor imüno-çökeltilmiş komplekste interaktörlerin varlığı, örneklerin bir anti-HA antikoru ile immünoblotlanmasıyla analiz edildi. Bu yöntemi kullanarak PER2'nin birkaç PPI'sını doğruladık. Sonuç olarak PER2'nin interaktörlerinin ko-immünopresipitasyon tekniği ile gösterilebileceği bir çalışma yürüttük. PER2'nin yeni moleküler ortaklarının belirlenmesi PER2'nin doğrudan veya dolaylı olarak etkileyebileceği biyolojik süreçlerin anlaşılmasına olanak sağlayacaktır.

The circadian clock is synchronized by light-dark cycles to control metabolism and physiology in a 24-hour cyclic manner. The endogenous circadian clock is generated by a transcription-translation feedback loop (TTFL) mechanism, and it is adjusted to 24-hour geological clock by sunlight. In the positive arm of the TTFL, BMAL1 and CLOCK transcription factors activate transcription of negative arm members PERIOD (PER) and CRYPTOCHROME (CRY) as well as other circadian clock-regulated genes. After translation, CRY and PER proteins inhibit BMAL1- CLOCK activity by protein-protein interactions (PPIs). Among the three PER proteins in humans, the PER2 protein, which has the highest oscillation, is found in the cytoplasm and nucleus in a circadian manner. Therefore, it is important to investigate proteins that interact with PER2. Our laboratory discovered new PPIs of PER2 using BioID methods. The aim of this study is to confirm some of those PPIs of PERs using co-immunoprecipitation technique. To this end, we transiently expressed HA-tagged interactors in a stable HEK293T-FLAGPER2 cell line. The proteins that interact with FLAG-PER2 were pulled down on antiFLAG antibody-coated magnetic beads and non-specific binders were washed away. The presence of the interactors in anti-FLAG antibody-immunoprecipitation complex was analyzed by immunoblotting the samples with an anti-HA antibody. We confirmed several PPIs of PER2 using this method. In conclusion, we conducted a study in which interactions of PER2 can be demonstrated by the co-immunoprecipitation technique. Identifying new molecular partners of PER2 will provide clues to understand biological processes affected by PER2 directly or indirectly.