Lon proteaz geninin çoklu kopyalarının streptomyces coelıcolor A3(2)'de homolog ifadesi ve Esherichia coli 'de heterolog ifadesi üzerine çalışmalar

Abstract

Streptomyces türleri uzayan ve dallanan hifler şeklinde vejetatif olarak üreyen gram pozitif toprak bakterileridir. Streptomyces coelicolor A3(2) en az 5 farklı antibiyotiği üretebilme özelliğine sahip olup genetik çalışmalarda sıklıkla kullanılan bir model organizma olarak dikkat çekmektedir. Streptomyces'lerde, hücre içi protein homeostazından sorumlu olan ATP bağımlı Lon proteazlar ile ilgili yapılan çalışmalar çok sınırlıdır. Sunulan bu çalışmada, S. coelicolor A3(2) Lon proteaz enziminin Escherichia coli'de ifadesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu ile S. coelicolor A3(2)'de yüksek düzeyde ifadesinin ikincil metabolizmaya etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada öncelikle, PZR ile çoğaltılan lon geni, ekspresyon vektörleri olan pET6xHN-C, pET28a(+) ve pET6xHN-N'e klonlanmıştır. Farklı konaklar kullanılarak yapılan çalışmalarda Lon proteininin ekspresyonu görülmemiştir. Bunun üzerine lon geninin kodonları E. coli'ye göre optimize edilmiş ve gen pET28a(+) ile pET6xHN-N vektörlerine klonlanmıştır. Yapılan bütün denemelere rağmen kodon optimize lon geninin ekspresyonu da farklı E. coli hücrelerinde sağlanamamıştır. Daha sonra, S. coelicolor A3(2)'de homolog ifadesinin sağlanması için lon geni, E. coli-Streptomyces mekik vektörü olan pSPG'nin gliserol ile uyarılabilen PglpF promotoru altına klonlanmış ve rekombinant vektör S. coelicolor A3(2) hücrelerine aktarılmıştır. lon geninin ifade edildiği RT-qPCR ile gösterilmiş, ardından olası protein bandı da SDS-PAGE jelde tespit edilmiştir. Yapılan antibiyotik ölçümleri sonucunda, fermentasyonun 120. saatinde rekombinant suşun yaban suşa göre aktinorhodin antibiyotiğini 25 kat, undesilprodigiosin antibiyotiğini ise 21 kat daha fazla ürettiği bulunmuştur. Çalışılan farklı katı besiyerlerinde ise rekombinant suşun yaban suştan daha fazla antibiyotik ürettiği ve sporlanma aşamasına daha erken girdiği görülmüştür.Streptomyces species are gram-positive soil bacteria that grow vegetatively in the form of elongated and branching hyphae. Streptomyces coelicolor A3(2) can produce at least 5 different antibiotics and draws attention as a frequently used model organism in genetic studies. Studies on ATP-dependent Lon proteases, which are responsible for intracellular protein homeostasis, are very limited in Streptomyces. The aim of this study is to determine the expression, purification and characterization of S. coelicolor A3(2) Lon protease enzyme in Escherichia coli and to determine the effect of high level expression of lon gene on S. coelicolor A3(2) secondary metabolism. First, PCR amplified lon gene was cloned into expression vectors pET6xHN-C, pET28a (+) and pET6xHN-N. Studies using different hosts showed no expression of Lon protein. The codons of the lon gene were then optimized for E. coli and the gene was cloned into pET28a(+) and pET6xHN-N vectors. Despite all attempts, expression of the codon optimized lon gene was not achieved in different E. coli cells. Then, for homologous expression in S. coelicolor A3(2), the lon gene was cloned under the glycerol-inducible PglpF promoter of the E. coli-Streptomyces shuttle vector, pSPG, and later recombinant vector was transferred into S. coelicolor A3(2) cells. Expression of the lon gene was shown by RT-qPCR, and then putative protein band was detected on SDS-PAGE gel. As a result of antibiotic measurements, it was found that at 120th hour of fermentation, recombinant strains produced 25 times more actinorhodin antibiotic and 21 times more undesilprodigiosin antibiotic than the wild type strain. In addition, it was observed that the recombinant strain of S. coelicolor A3(2) produced more antibiotics than wild type and entered the sporulation phase earlier in different solid media.