İnsan stroma ve monosit hücre hatlarında DEK1 ve DEK2 izoformlarının salgılanmasının belirlenmesi

Abstract

Hematopoez, hematopoietik kök hücrelerin miyeloid, lenfoid ve eritroid soylara farklılaştığı ve olgunlaştığı, kemik iliği nişlerinde gerçekleşen fizyolojik bir süreçtir. Kan hücrelerinin olgunlaşması, immün yanıtın oluşumu ve düzenlenmesi, kemik iliği mikroçevresindeki hücrelerden salgılanan sitokinler ve bu hücreler arasındaki etkileşimlerle sağlanır. DEK, uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin devamlılığını sağlama ve bu hücrelerin kendini yenileme fonksiyonları için gereklidir. DEK ekspresyon seviyesi hematopoetik ve epitel kökenli çoğalan hücrelerde, farklılaşan-olgunlaşan hücrelere göre daha yüksektir. Aktive olan makrofajlardan salgılandığı bilinen DEK'in kemoatraktan rolü kanser, inflamasyon ve otoimmün hastalıklarda potansiyel bir terapötik hedef olabileceğini düşündürmektedir. DEK'in bilinen iki izoformu mevcuttur (DEK1 ve DEK2) ve özetlenen fonksiyonların tamamı literatürde DEK olarak bilinen DEK1 için araştırılmıştır. Çünkü genel olarak tüm hücrelerde DEK1'in ekspresyon seviyesi DEK2'ye göre daha yüksektir. İlave olarak, mevcut ticari antikorlarla Western blot yöntemiyle ancak DEK1 izoformu tespit edilebilmektedir. Bu tez çalışmasında, DEK1 ve DEK2'nin Hs27A insan kemik iliği stroma hücre hattında ve U937 pro-monosit hücre hattında hücre proliferasyonuna etkisi ve bu hücrelerden salgılanıp salgılanmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Myc epitopu ile füzyon haldeki DEK1 ve DEK2 genleri MSCV-IRES-GFP retroviral ekspresyon vektörüne klonlandı ve retroviral transdüksüyonla kalıcı olarak MycDEK1 veya MycDEK2 eksprese eden U937 ve Hs27A hücreleri elde edildi. Bu hücrelerde aşırı DEK1 veya DEK2 ifadesinin hücre çoğalmasını etkilemediği gözlendi. Ayrıca, farklı konsantrasyonlarda toplanan hücre medyumunun Western blot ve ELISA analizi, DEK izoformlarının U937 veya Hs27A hücrelerinde saptanabilir seviyelerde salgılanmadığını gösterdi. Bu durumun IL-8 veya PMA gibi uyaranlar varlığında da değişmediği tespit edildi. Bu tez çalışması TÜBİTAK tarafından 118Z765 no'lu 1001 projesi ile desteklenmiştir.Hematopoiesis is a physiological process that takes place in bone marrow niches where hematopoietic stem cells differentiate and mature into myeloid, lymphoid and erythroid lineages. Maturation of the blood cells, formation and regulation of the immune response are mediated by cytokines secreted from cells in the bone marrow microenvironment and the interactions between these cells. DEK is necessary for the maintenance and self-renewal of long-term hematopoietic stem cells. DEK expression level is higher in proliferating hematopoietic and epithelial cells when compared to the differentiated-matured cells. The chemoattractant role of DEK secreted from activated macrophages suggests that it may be a potential therapeutic target in cancer, inflammation and autoimmune diseases. There are two known isoforms of DEK (DEK1 and DEK2) and all of the functions outlined have been investigated for DEK1 that is known as DEK in the literature. Because the expression level of DEK1 is higher than DEK2 in general. In addition, only DEK1 isoform can be detected by Western blot method with available commercial antibodies. In this thesis, we aimed to determine whether DEK1 and DEK2 are secreted from the Hs27A human bone marrow stroma cell line and U937 pro-monocyte cell line as well as if they effect the proliferation. For this purpose, Myc epitope tagged DEK1 and DEK2 genes were cloned into the MSCV-IRES-GFP retroviral expression vector and U937 and Hs27A cells permanently expressing MycDEK1 or MycDEK2 were obtained by retroviral transduction. Using these cell lines, we found that DEK1 or DEK2 overexpression did not affect proliferation. In addition, Western blot and ELISA analysis of the conditioned medium obtained from these cells showed that under the experimental conditions that we used both DEK isoforms were not secreted from the U937 or Hs27A cells at the detectable levels, in presence or absence of PMA or IL-8. This thesis study was supported by TUBITAK 1001 project (grant number 118Z765).