Staphylococcus saprophyticus fosfotransasetilaz'ın kinetik ve mekanizmasının incelenmesi

Abstract

Bu çalışmamızda, Staphylococcus saprophyticus'dan ilk defa bizim laboratuarda klonlanan ve Escherichia coli'de exprese edip saflaştırılan fosfotransasetilazın (Pta) kinetik ve mekanizmasını inceledik.Pta'nın katalizlediği reaksiyonun üçlü kompleks veya ping-pong mekanizmasıyla olup olmadığını ayırt etmek için, farklı substrat konsantrasyonlarında ileri ve geri reaksiyonların başlangıç hızları ölçülerek, 1/v'ye karşı 1/substrat grafiği çizildi. Elde edilen grafiklerin paralel olmayıp kesiştiği görüldü. Bu sonuçlar, Pta'nın katalizlediği ileri ve geri reaksiyonun mekanizmasının üçlü kompleks mekanizmasıyla gerçekleştiğini göstermektedir. Pta'nın katalizlediği reaksiyonun üçlü kompleks mekanizmaları olan rastgele (random) ve sıralı (ordered) iki substrat-iki ürün mekanizmasından hangisi olduğunu belirlemek için de ürün inhibisyonu deneyleri yapıldı. Ürün inhibisyon deneyleri sonucunda Pta'nın katalizlediği reaksiyon mekanizmasının rastgele iki subtrat-iki ürün (rapid equilibrium random bi-bi) mekanizması olduğu görüldü.Ayrıca, bazı metabolitlerin (NADH, pirüvat, ATP ve ?-ketoglutarat) S. saprophyticus Pta'nın aktivitesi üzerine etkisi de çalışıldı. NADH ve pirüvatın herhangi bir etkisi gözlenmezken, ATP ve ?-ketoglutarat'ın ileri ve geri reaksiyonu inhibe ettiği görüldü. ATP'nin CoA'ya karşı yarışmalı, Ac-Pi'ye karşı ise yarışmasız inhibitör olduğu belirlendi. ?-Ketoglutarat'ın ise Pta için allosterik bir inhibitör olduğu görüldü; ileri ve geri reaksiyon için yarı-doygun konsantrasyonu 6.5 ± 0.7 mM, ve Hill sabiti, sırasıyla, 2.6 ± 0.8 ve 3.3 ± 0.2 olarak hesaplandı.

In this study, we investigated the kinetics and mechanism of Pta which was cloned from Staphylococcus saprophyticus by İlknur Aksoy of this laboratory.The initial velocity pattern of two substrate, two product reaction catalyzed by Pta were investigated in order to differentiate between ternary complex kinetic mechanism and a ping-pong kinetic mechanism. The initial velocity patterns are consistent with a kinetic mechanism that proceeds via formation of ternary complex between Pta and both subsrates prior to any chemical step, rather than via a ping-pong mechanism. The product inhibition patterns of the reaction catalyzed by Pta were analyzed to determine if substrate binding and product release are random or ordered. Inhibition of the forward (acetyl-CoA forming) reaction catalyzed by Pta by product inhibitors, acetyl-CoA and inorganic phosphate, was analyzed with respect to various concentrations of the substrates, CoA and acetyl phosphate, using the standard activity assay. Kinetic analysis and product inhibition studies indicated that there is a kinetic mechanism that proceeds through random addition of both substrates to the enzyme prior to any chemical step.Furthermore, effect of some metabolites on the activity of Pta have been investigated. The enzyme was inhibited in both forward and reverse directions by ATP and ? -ketoglutarate but not affected by pyruvate and NADH. ATP was competitive with respect to CoA and noncompetitive with respect to acetyl-phosphate. The inhibition by ? -ketoglutarate, however, was allosteric with half-saturations at 6.5 ± 0.7 mM and Hill coefficients of 2.6 ± 0.8 and 3.3 ± 0.2, in forward and reverse directions, respectively, presenting the first example of allosteric regulation of a member of class I Ptas.