Alternative polyadenylation and metabolic reprogramming in lung adenocarcinoma using single cell rna sequencing data

Abstract

Adenokarsinom tipi akciğer kanseri (LUAD), genetik ve transkriptomik düzeyde yüksek heterojenlik gösteren bir malignitedir ve bu durum tanı ve tedavi stratejilerini karmaşıklaştırmaktadır. Transkriptomik düzenlemenin yeni ortaya çıkan katmanları arasında yer alan alternatif poliadenilasyon (APA) ve metabolik yeniden programlanma, kanser progresyonunda kritik roller oynamakta; ancak tek hücre düzeyinde yeterince karakterize edilmemiştir. Bu tezde, LUAD'da 3?-uç bölgesi (3?-UTR) heterojenliği ve metabolik plastisite sistematik olarak incelenmiş ve bu amaçla halka açık tek hücreli RNA dizileme (scRNA-Seq) veri kümeleri kullanılmıştır. APA dinamiklerini analiz etmek için, Sierra ve movAPA paketleri kullanılarak dört farklı LUAD scRNA-Seq veri kümesinde 3?-uç zirve (peak) tespiti ve farklı kullanımları değerlendirilmiştir. DSTN, EIF1 ve TM4SF1 gibi genlerin dahil olduğu 31 genlik ortak bir kümenin, en az üç veri setinde tekrarlayan APA olaylarına uğradığı bulunmuştur. Bu APA değişimlerine uğrayan genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizleri, lizozomal fonksiyon, azurofil granül ve salgı yolu membranı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Ayrıca, primer ve metastatik tümör hücrelerinin karşılaştırılması, tümör yayılımıyla ilişkili özgün APA imzalarını ortaya koymuştur. Geniş APA kullanım heterojenliğine rağmen, movAPAswitch ile belirlenen poliadenillenme bölgesi (PAC) değiştirme olayları daha nadir görülmüş ve örnek spesifikliği yüksek bulunmuştur, bu da bu olayların bağlama özgü doğasına işaret etmektedir. Metabolik heterojenlik, hücre kümesi düzeyinde reaksiyon akılarını tahmin eden METAFlux ve hücre bazlı yolak aktivite skorlarını hesaplayan scMetabolism olmak üzere iki tamamlayıcı yaklaşımla incelenmiştir. Entegre analizler, farklı metabolik akı dağılımları ve yolak bağımlılıkları gösteren tümör alt popülasyonlarını ortaya çıkarmış ve LUAD için in silico metabolik atlas oluşturulmasını sağlamıştır. Bu atlas, glutamin anaplerozu ve lipid kullanımındaki değişiklikler gibi metabolik ağlardaki potansiyel zayıf noktaları vurgulamaktadır. Bunlara ek olarak, scRNA-Seq verilerinde grafik tabanlı kümeleme için parametre seçiminin zorluklarını aşmak amacıyla, SUMA adında bir rastgele orman algoritmasına dayalı sınıflandırıcı model geliştirilmiş ve doğrulanmış veri setleri üzerinde eğitilmiştir. SUMA, optimal kümeleme parametrelerini yüksek doğrulukla tahmin ederek, hücre tipi çözünürlüğünü otomatikleştirir ve sonraki analizlerde tutarlılığı garanti altına alır.Lung adenocarcinoma (LUAD) is a highly heterogeneous malignancy, both genetically and transcriptionally, complicating diagnosis and therapeutic interventions. Among the emerging layers of transcriptomic regulation, alternative polyadenylation (APA) and metabolic rewiring play crucial roles in cancer progression but remain insufficiently characterized at the single-cell level. This thesis employs publicly available single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) datasets to systematically explore 3? untranslated region (3?-UTR) heterogeneity and metabolic plasticity in LUAD. To capture APA dynamics, 3?-end peak detection and differential usage analysis were performed using the Sierra and movAPA packages across four LUAD scRNA-Seq datasets with available raw read files. A core set of 31 genes, including DSTN, EIF1, and TM4SF1, were found to undergo recurrent APA events in at least three datasets, suggesting conserved regulatory patterns in tumor cells. Functional enrichment of these APA-altered genes revealed strong associations with lysosomal function, azurophil granules, and secretory pathways. Additionally, analysis of primary versus metastatic tumor cells identified unique APA signatures associated with tumor dissemination. Despite broad APA usage heterogeneity, polyadenylation clusters (PAC) switching events—quantified using movAPAswitch—were comparatively infrequent and showed high sample specificity, underscoring their context-dependent nature. Metabolic heterogeneity was examined using two complementary approaches: METAFlux, which infers reaction fluxes at the cluster level, and scMetabolism, which scores pathway activity at the single-cell level. Integrated analyses revealed tumor subpopulations with distinct flux distributions and pathway dependencies, enabling the construction of an in silico metabolic atlas of LUAD. This atlas highlights potential vulnerabilities in metabolic networks, including glutamine anaplerosis and altered lipid utilization. Collectively, these findings illuminate the underexplored regulatory layers of APA and metabolic rewiring in LUAD and underscore the value of single-cell resolution in resolving tumor complexity. Also, to address the challenge of parameter selection in graph-based clustering of scRNA-Seq data, a random forest classifier, SUMA, was developed and trained on benchmarking datasets. SUMA accurately predicts optimal clustering parameters, providing a robust and automated solution for reproducible cell-type resolution and ensuring consistency across downstream analyses.