NADP+ -Bağımlı Format Dehidrojenaz Enziminin Hesaplamalı ve Deneysel Yöntemlerle Moleküler Mühendisliği

Abstract

Format dehidrojenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), nikotinamid adenin dinükleotid (NAD(P) kofatörünü hidrür (H-) transferi yoluyla indirgerken, format (HCOO-) iyonunun karbondioksite yükseltgenme reaksiyonunu katalizleyen enzimlerdir. İnce kimyasalların sentezlendiği proseslerde, koenzim geri dönüşümünde (rejenerasyonunda) görev almaları nedeniyle önemli endüstriyel enzimlerden birisidir. FDH’ın katalitik mekanizmasında hidrür transferi ve kofaktor bağlanmasının hız belirleyen en önemli basamaklar olması ve diğer dehidrogenaz katalizli reaksiyonlarda görülen proton salma basamaklarını içermemesi; formatın dehidrojenaz substratları içerisinde en basit yapılı substrat olması, bu reaksiyonun moleküler mekanizma çalışmalarında model alınmasına sebep teşkil etmektedir. Doğal FDH’ların çoğunun NAD+ koenzimine ilgisinin yüksek olması, FDH’ın NADH rejenerasyonu için yaygın olarak kullanılmasını sağlarken, NADPH rejenerasyonu için kullanımını kısıtlamaktadır. Bu projede, Burckholderia sp. den elde edilmiş (Bsp383FDH) ve kristal yapısı aydınlatılmış olan NADP-spesifik format dehidrojenaz kullanılarak ve moleküler mühendislik yoluyla hem deneysel hem de hesapsal yöntemler kullanılarak Bsp383FDH enziminin kofaktör bağlanmasına etki eden aktif bölge amino asitlerin etkilerininin incelenmesini içermektedir. Bu sayede yapı-fonksiyon ilişkisinin moleküler seviyedeki etkileşimleri incelenmiştir. Bu enzimin NADP+ seçiciliği ve etkinliği ve rasyonel mutant dizaynının NADP+ bağlanmasına olan etkileri, hesaplamalı kimya yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre bağlanma bölgesinin en önemli amino asiti (Q223) doygun mutasyon yöntemiyle diğer aminoasitlere çevrilerek kinetik parametler hasaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, Bsp383FDH bilinen diğer format dehidrogenazların aksine nikotinamid kofatörlerinden NADP+ yi NAD+ ye tercih etmektedir. Böyle bir özelliğin olması büyük ölçüde kofaktör bağlanma bölgesinde bulunan glutamin aminoasitinin varlığından kaynaklanmaktadır (Q223). Bu projede, Q223 pozisyonundaki glutamin aminoasiti, teorik çalışmalar eşliğinde mutasyon teknikleri kullanılarak (doygun veya yönlendirilmiş) mümkün olan tüm aminoasitler ile yer değiştirilmiştir. Oluşturulan mutant enzimlerden aktivite gösteren tüm mutantların rekombinant üretimi, saflaştırılması ve kinetik çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, doğal tip enzimle karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmalar, NADP+, NAD+ ve format (hem NADP+ hemde NAD+ ortamında) yönünden kinetik parametreleri hesaplanarak (KM, kcat ve kcat/KM) incelenmiştir.