DEK3 izoformunun fonksiyonel analizi

Abstract

DEK, DNA'ya bağlanabilen, çekirdekte lokalize olan, hücre migrasyon ve proliferasyonunda etkili olduğu bilinen bir proteindir. Literatürde DEK genin kodladığı tam protein dizisine sahip olan DEK-izoform 1 (DEK1) ağırlıklı olarak araştırılmıştır. Ancak DEK geninin, alternatif mRNA kırpılması ile oluşan ve ifade düzeyi DEK1'den oldukça düşük olan DEK-izoform 2'yi (DEK2) de kodladığı da bilinmektedir. Laboratuvarımızda yürüttüğümüz henüz yayınlanmamış araştırmalarımız DEK'in alternatif kırpılma ile DEK3 olarak adlandırdığımız farklı bir izoform daha oluşturduğunu göstermiştir. Bu tez çalışmasında, DEK1'de bulunan 253-348 arasındaki amino asitleri içermeyen bu DEK3 izoformunun fonksiyonel özellikleri diğer iki izoformla karşılaştırılarak araştırılmıştır. Bu amaçla, HS-27A kemik iliği hücre hattında Flag etiketi eklenmiş DEK izoformları retroviral yöntemle kalıcı olarak aşırı ifade ettirilmiştir. İmmünofloresan boyamayla DEK3'ün DEK1'e benzer olarak çekirdekte yaygın boyanma gösterdiği tespit edilmiştir. Yara kapanma (wound healing) deneyleri, kontrol hücrelerine kıyasla DEK1 (p değeri: 0.034) ve DEK2 (p değeri: 0.0006) izoformlarının aşırı ifadesinin hücre migrasyonunu azalttığını, DEK3 izoformununsa fark oluşturmadığını göstermiştir. Proliferasyon deneyleri, her üç izoformun da DEK3'te daha belirgin olarak, kontrole kıyasla hücre çoğalmasını hafif oranda ve istatistiksel olarak anlamlı seviyede yavaşlattığını (DEK1 p değeri: 0.0011; DEK2 p değeri: 0.002) ve bununla uyumlu olarak, üç izoformun da hücre döngüsünün G2/M evresinde birikmeye (arrest) sebep olduğunu, göstermiştir. Son olarak, kullandığımız deneysel koşullarda üç izoformun da HS-27A hücrelerinden Western blot yöntemiyle tespit edilebilecek düzeyde salgılanmadığı tespit edilmiştir. Özetle, bu tez çalışmasında DEK3 izoformu ilk kez tanımlanmıştır. Sonuçlarımız DEK izoformlarının HS-27A hücrelerinin migrasyonu ve çoğalmasında farklı etkilere sahip olduğunu, DEK'in 253-348 arasındaki amino asit bölgesinin varlığının özellikle migrasyonu yavaşlatıcı etkiye sahip olduğunu göstermiştir.DEK localizes in the nucleus, binds to DNA and affects cell migration and proliferation. DEK-isoform 1 (DEK1; called DEK), which has the complete protein sequence encoded by the gene, has been heavily investigated. However, it is also known that the DEK gene encodes DEK-isoform 2 (DEK2), which is formed by alternative mRNA splicing and has a much lower expression level than DEK1. Our as-yet unpublished research has shown another DEK mRNA isoform, which we call DEK3. In this thesis, the functional properties of DEK3 isoform, which does not contain amino acids 253-348 in DEK1 were investigated. For this purpose, flag-tagged DEK isoforms were stably overexpressed in the HS-27A bone marrow cell line by retroviral method. Immunofluorescence staining showed that DEK3 diffusely locates in the nucleus, similar to DEK1. Overexpression of DEK1 and DEK2 isoforms reduced cell migration compared to control cells (DEK1 p value: 0.034; DEK2 p value: 0,0006), whereas DEK3 isoform made no difference. In addition, all three isoforms slowed cell proliferation slightly and statistically significantly (DEK1 p value: 0.0011; DEK2 p value: 0.002) compared to control. Consistently, all isoforms caused arrest in the G2/M phase of the cell cycle. Finally, we found that all isoforms were not secreted from HS-27A cells at a level detectable by Western blot method. DEK3 isoform was described for the first time in this thesis. We showed that DEK isoforms have different effects on the migration and proliferation of HS-27A cells, and the presence of amino acid region 253-348 of DEK reduces migration.