Alkol dehidrogenaz bağlı manyetik nanopartiküllerin kiral alkol üretiminde kullanılmak üzere geliştirilmesi

Abstract

Özgün özellikleri ve biyomoleküllerle aynı boyutta olma durumları gibi çeşitli özelliklerinden dolayı nanopartiküllere ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Bu özelliklerle birlikte manyetik nanopartiküller nanokatalizör olarak enzim-nanopartikül konjuge sistemi olarak hazırlanabilmektedir.Bu çalışmada hem katekol grubu ile modifiye hem de modifiye olmamış manyetik demir oksit nanopartikülleri sentezlenmiştir. Süperparamanyetik özellikte oldukları belirlenmiş ve çeşitli metotlarla yüzey karakterizasyonları yapılmıştır.Biyokatalizör olarak kullanılacak alkol dehidrogenaz enzimi mezofilik olan Staphylococcus saprophyticus bakterisinden pET14b vektör sistemine klonlanmıştır. Tahmini alkol dehidrogenaz genini taşıyan pET14b plazmidi E. Coli BL21(DE3) ekspresyon kompetent hücrelerine aktarılmıştır. Hem IPTG indüksiyonu ile hem de oto-indüksiyon besiyerinde eksprese edilen alkol dehidrogenaz enzimi inklüzyon cisimciği olarak elde edilmiştir. in vivo doğru katlanma veya in vitro tekrar katlanma çalışmaları sonucu alkol dehidrogenaz enzimi saf olarak elde edilmiş ancak aktif formda elde edilememiştir. Bu proteinle ilgili çalışmalar devam etmektedir. Bu nedenle çalışmalarda Bacillus thuringiensis kaynaklı alkol dehidrogenaz enzimi kullanılmıştır.İmmobilizasyon sisteminin ekonomik olmasını sağlamak için kofaktör rejenerasyonunda Candida methylica kaynaklı format dehidrogenaz kullanılmış ve tüm immobilizasyon sistemleri bu enzim ile optimize edilmiştir.Manyetik nanopartiküllere OXDC ve cmFDH koimmobilizasyonu başarı ile gerçekleştirilmiştir. Kiral alkol üretiminde kullanılmak üzere dizan edilen alkol dehidrogenaz ve format dehidrogenaz birlikte immobilizasyon çalışmaları geliştirilmektedir.Nanomaterials have atracted great interest because of specific properties such as magnetic behavior and conductivity and various attributes, including the similar size of biomolecules. Nanoparticles have designed enzyme-nanoparticles conjugate system as nanocatalyst with this properties.In this study, both catechol modified and unmodified magnetic iron oxide nanoparticles were synthesized and surface characterizations were analyzed with various methods.Alcohol dehydrogenase as biocatalyst was cloned into pET14b vector system from Staphylococcus saprophyticus. pET14b vector containing putative alcohol dehydrogenase gene was transformed into E.Coli BL21(DE3) expression competent cells. Alcohol dehydrogenase was expressed as inclusion bodies with IPTG induction and in auto-induction medium. Alcohol dehydrogenase enzyme was purified as pure but not in active form with in vivo and in vitro refolding applications. Therefore alcohol dehydrogenase from Bacillus thuringiensis was used in this study.Formate dehydrogenase from Candida methylica was used for cofactor regeneration that makes immobilization system economic and all systems were optimized with formate dehydrogenase.Oxalate decarboxylase and formate dehydrogenase coimmobilization was carried out successfully. Alcohol dehydrogenase and formate dehydrogenase coimmobilization have been developed for chiral alcohol synthesis.