Streptomyces coelicolor'da lon proteaz, sınırlandırılmış cevap, polifosfat metabolizması ve antibiyotik üretiminin ilişkilendirilmesi

Abstract

Bakterilerde besin kıtlığı, ısı şoku gibi çeşitli stres durumlarında sentezlenen alarmonlar [(p)ppGp], polifosfat (poliP) polimerinin hücrede birikimini tetiklerler. Esherichia coli'de poliP'nin, hücre için hayati önemi olan pek çok fizyolojik proseste görev alan Lon proteaza bağlanarak bir kompleks oluşturduğu, bu kompleksin de ribozomal proteinleri yıkarak strese adaptasyonu sağlayan enzimlerin sentezinde kullanılacak yeni amino asitleri oluşturduğu bilinmektedir. Diğer bakterilerde poliP ve Lon arasında böyle bir ilişkinin olup olmadığı bilinmemektedir. Antibiyotik üretiminin regülasyonunun incelendiği çalışmalarda sıklıkla model organizma olarak tercih edilen Streptomyces coelicolor'da, çeşitli genlerin ve strese neden olan farklı çevresel sinyallerin sekonder metabolit üretimini etkilediği belirlenmiştir. Bu çalışmada, genomunda bir ekstra lon geni bulunduran yüksek antibiyotik üreticisi rekombinant S. coelicolor suşunda, sınırlandırılmış cevap (relA), poliP metabolizması (ppk), ikincil metabolit üretimi (actII-ORF4, redK) ve stres bağlantılı (sigB) genlerin transkripsiyonel analizleri yapılmıştır. Rekombinant suşta bu genlerin ekspresyon seviyelerinde yaban suşa kıyasla önemli artışlar tespit edilmiştir. Çalışma kapsamında, ayrıca poliP üretemeyen yüksek antibiyotik üreticisi S. coelicolor M145 ?ppk suşunun genomuna ekstra bir kopya lon geni entegre edilerek mutant bir suş (?ppk+pRAlon+Str) oluşturulmuştur. Bu suşun, normalden çok daha yavaş büyüdüğü ve antibiyotikleri ölçüm yapılamayacak kadar az ürettiği gösterilmiştir. Bu durum, poliP yokluğunda ekstra bir kopya lon geninin hücrede aşırı düzeyde stres yaratarak yaşamsal faaliyetlere sekte vurmasıyla ilişkilendirilmiştir. Bu tez çalışmasının sonuçları, E. coli'de öngürülen Lon proteaz-poliP etkileşiminin S. coelicolor'da da var olduğunu gösteren ön verileri sunmanın yanında, Lon proteaz, (p)ppGpp, poliP ve ikincil metabolit üretimi arasındaki kompleks ağın aydınlatılmasına da önemli katkı sağlamaktadır.

Bacteria synthesize alarmones in response to stress conditions such as food deprivation and heat shock. Alarmones induce the accumulation of polyphosphate (polyP) polymer in the cell. PolyP in Esherichia coli is known to form a complex by binding to Lon protease, which is involved in many physiological processes that are vital to the cell, and this complex breaks down ribosomal proteins to form new amino acids for the synthesis of enzymes that provide adaptation to stress. It is not known whether there is such a relationship between poliP and Lon in other bacteria. Streptomyces coelicolor is used as a model organism for studies on the regulation of antibiotic production and these studies have shown that a diverse set of genes and external factors that cause stress affect secondary metobolite biosynthesis. In this study, we analyzed the transcription of genes involved in stringent response (relA), polyP metabolism (ppk), secondary metabolite production (actII-ORF4, redK) and stress response (sigB) in a high antibiotic producer recombinant S. coelicolor strain with an extra lon gene in its genome. We have seen a significant increase in the expression of these genes compared to wild type. Within the scope of this study, we have also created a mutant strain, (?ppk+pRAlon+Str), by integrating an extra copy of lon gene into the genome of high antibiotic producer S. coelicolor M145 ?ppk strain which cannot synthesize polyP. It is shown that this strain has slower growth rates compared to wild type and produce undetectable levels of antibiotic. We hypothesize that extra copy of lon gene generates high levels of stress in the absence of polyP, which in turn hinders vital activities. Results of this thesis not only provides the preliminary data that Lon protease-polyP interaction predicted in E. coli also exists in S. coelicolor but also sheds light on the complex network between Lon protease, (p)ppGpp, polyP and secondary metabolite production.